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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选重组DNA分子的酶切、连接、转化和筛选摘 要：本实验利用酶切后的目的片段（500bp）与puc18为材料，运用氯化钙法制备感受态细胞和外源的重组体DNA转入受体菌细胞，经过筛选培养基筛选后得到重组子。关键词：酶切 重组 筛选前 言 重组克隆是指含有外源DNA的细胞增殖而产生的细胞群体，或由其经
2、生长、发育和再生而形成的组织、器官、个体。重组克隆的筛选主要依靠DNA载体上的选择标记，加上合适的选择（培养）条件来进行。一是通过选择培养基使只有带外源DNA的细胞才能生长；二是根据选择性遗传标记选择带有目的基因的细胞克隆。1材料与方法1.1材料质粒DNA、目的DNA、E.coli受菌体、质粒pUC18、重组体DNA1.2方法1.2.1PCR法扩增目的片段（CER3A）1.2.1.1 PCR反应体系反应物体积/ulPCR Taq mix12.5CER3Ar，CER3Af各1dd水9.5质粒CER3A11.2.1.2 PCR扩增条件 在PCR仪上设计945min，然后进入循环，循环中第一步为94
3、30s，第二步为58退火30s，第三步为72延伸1min，共进行35次循环，然后再72延伸10min以提高产物的扩增率，取出放在4条件下终止反应。1.2.2目的片段的电泳 将10倍loading buffer 5ul和25ulPCR产物混匀，在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳，分析。1.2.3目的片段的回收 通过琼脂糖电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀，将含目的片段DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入2ml离心管称重。根据凝胶重量和浓度，按每100mg琼脂糖加400ml的比例加bufferB2。将离心管置于50水浴510min，间或混匀，直至胶块完全溶化。在酶切反应体系中加入5倍bu
4、fferB2，混匀。将熔化好的溶液全都移到吸附柱，静止2min，8000g离心30s，倒掉收集管的液体，将吸附管放入同一收集管中。向吸附管中加入加入500ul Wash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附管放在同一根收集管中。重复步骤（6）一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，12000g离心2min，打开瓶盖，放置25min，挥发酒精。换新的1.5ml离心管，在吸附膜中加入20ul dd水（pH8.0），温室静置5min，12000g离心2min，将所得的DNA溶液置于-20保存或用于后续实验。反应物体积/ul目的片段15Sad1.5Pst1.510loadin
5、g buffer10dd水72 1.2.4目的片段和pUC18质粒的酶切1.2.4.1目的片段的酶切在37反应12h。1.2.4.2 pUC18质粒的酶切反应物体积/ulpUC1815Sad1.5Pst1.510loading buffer10dd水72在37反应12h。然后将吸取2ul酶切产物，加入10loading buffer 1ul和dd水7ul，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，观察并分析结果。1.2.5 DNA片段与质粒pUC18的连接（体积的量不确定）反应物体积/ul目的片段5pUC1856loading buffer1T4 ligase21.2.6重组体DNA遗传转化与克隆筛选1.2
6、.6.1感受态细胞的制备 取对数生长期的大肠杆菌培养物1ml于离心管中7000r/min离心35min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。用1ml预冷的0.05mol/L CaCl2悬浮菌体，于离心管中7000r/min离心35min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。再用1ml预冷的0.05mol/L CaCl2悬浮菌体，冰浴15min，7000r/min离心35min，倾去上清液后收集菌体置于冰浴中。加入100ul预冷0.05mol/L CaCl2悬浮后即为感受态细胞，可在4下保存一周。1.2.6.2重组体DNA的遗传转化与克隆筛选 常温下熔化感受态细胞，加入重组体DNA40ng左右，冰浴30
7、min。42热击90s，冰浴5min，加入1mlLB培养基，37温育1h。区230ul菌体悬浮培养物加入30ul IPTG和40ulX-gal，混合均匀后在氨苄青霉素的LB固体培养基平板上涂布均匀，注意不要划破平板培养基表面，于37温育过夜。挑选重组体细胞克隆：在固体培养基平板上的蓝色菌落为带质粒但不含目的基因片段的克隆；白色菌落为带有目的基因片段或外源DNA的重组克隆。各重组克隆可进一步增殖，用于建立基因文库，或进行外源基因片段的序列分析。2实验试剂与仪器设备2.1实验试剂2.1.1电泳试剂 上样缓冲液；TBE缓冲液；2.1.2 DNA内切酶 EcoR试剂盒2.1.3 T4DNA连接酶2.1
8、.4 T4DNA连接酶缓冲液 20mmol/L Tris-HCl（pH7.6），5mmol/LMgCl2，0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT和500ug/mL BSA溶于灭过菌的重蒸水中；2.1.5标准DNA样品 DNA；DNA/EcoR；DNA/Hind ；2.1.6含有EcoR和Hind 识别序列的质粒DNA；2.1.7目的DNA样品；2.1.8其他试剂 苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）；氯仿；异丙醇；乙醇；3mol/L NaAc；TE缓冲液；2.1.9培养基 LB液体培养基；含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基；2.1.10 0.05mol/L CaCl2，置于
9、冰箱中预冷；2.1.11克隆试剂 28.2mg/mL IPTG（异丙基硫代半乳糖苷），配2mL；20mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚品吡喃乳糖苷，溶于二甲基甲酰胺中，-20避光保存），配2mL。2.2实验仪器设备 高速离心机、恒温水浴锅、移液器、紫外观测仪、凝胶成像装置、水平电泳槽、双稳电泳仪、低温冰箱、恒温摇床、电热恒温培养箱、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、离心管、微波炉、试管、培养皿、三角瓶150mL和500mL、烧杯、灭菌牙签。3结果与分析（1） 目的片段的扩增左图为目的片段（500bp）PCR扩增后的电泳图，从图中可以看到，PCR产物的质量和数量，条带清晰可见
10、，亮度也很好，可以说PCR的产物其质量很好，数量也是不少的，因此可以用此产物进行下一步的实验。 （2）目的片段的回收左图为目的片段（500bp）自凝胶中回收后的电泳图，从图中可以看到条带明亮且清晰，说明回收效果不错，其质量很好，数量不少，可以用此产物进行下一步的实验。 （3）目的片段与puc18的酶切左图为目的片段与puc18酶切后的电泳图，图中较长的两条条带是500bp的，短的一条是puc18的条带，可以看到条带是比较清晰，有一定亮度，因此认定此材料能继续完成下一步的实验（4）蓝白斑的筛选左图为重组体DNA遗传转化与克隆后的筛选，图中可以看到蓝色斑的附近布满了大大小小的白斑，而白斑的出现即说
11、明了我们的重组体成功地转化了，蓝斑是没有转化的结果，而从图中的右下角有一个比较大的白斑，此处为培养基污染了长菌，并不是白斑。（5）蓝白斑的鉴定左图为白斑的鉴定电泳图，可从图上看出，我们的条带一致，进过与MARK对比可知是目的产物，但第一条带中有一些的拖尾现象，第二条带亮度有点分散，不太凝聚，说明白斑的质量不是非常的好，应该还需要培养一下。4结论与讨论（1）在电泳后回收片段的时候，切胶不能切太厚，因为一是这样的话胶会溶解得比较慢，二是胶太多了，而我们加的试剂的量没有变的情况下会影响整个回收的质量。所以说，有时候虽然实验指导上有明文写出我们的用量，但在一定的情况下，我们可以根据试剂的情况适当的加量或者是减量，不能一味的照本宣科。（2）因为此实验需要多次的电泳以确定我们产物的质量，因此制胶的技术需要非常的熟练，另外因根据目的片段越小，胶越浓的原则来配胶。（3）在制作感受态细胞的过程中，因细胞处于脆弱状态，我们的动作必需是轻柔的，不然会影响细胞的制作，严重的会导致其死亡，另外，整个的制作过程必需处于冷冻的状态，这也是保护感受态细胞的一项措施。（4）在进行蓝白斑筛选的时候，我们的培养基迟迟都没有现象，估计是因为在接到培养基时，我们的接种棒烧得太热没有冷却好，以致大多数的目的菌都被烧死了，另外就是我们的无菌操作技术还是不太行，培养基依然有污染的情况。-