遗传学实验指导.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date遗传学实验指导遗传学实验简介遗传学实验简介课程名称： 遗传学实验课程性质： 随课实验课程属性： 基础课学时学分： 学时16 学分1面向专业： 一、课程的任务和基本要求遗传学实验是生物学所有专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合遗传学的教学而开设的一门实验课程,本课程由基础操作性、综合性和设计性等多层次实验内容构成，目的在于巩固和加深学生对遗传学

2、知识的理解、验证遗传学理论、并初步掌握遗传学研究所必需的基本实验技术。在此基础上，进行一定比例的综合性、设计性实验，将实验理论和实验技能融为一体，从而培养学生的基本实验思想、实验方法、实验技能和综合应用能力。本课程的任务是从个体、细胞水平揭示遗传学的基本现象与规律，培养学生牢固掌握经典遗传学研究方法与技术，并初步掌握现代遗传学实验操作技能，熟悉遗传学分析方法，同时要求学生初步具备进行遗传学创新性研究的基本能力与素质。二、实验项目植物染色体核型分析果蝇的培养及生活史和形态观察小鼠骨髓染色体的制片及观察人群中基因频率的调查人类巴氏小体观察三、有关说明1、与其它课程和教学环节的联系先修课程：动物学、

3、植物学、生物化学、微生物学后续课程：分子生物学、基因工程、人类遗传学平行开设课程：细胞生物学2、教材和主要参考书目（1）教材：刘祖洞 江绍慧 遗传学实验 高等教育出版社 1987年第二版（2）主要参考书目 张文霞等编 遗传学实验指导 高等教育出版社 2005 年版 张贵友等编 普通遗传学实验指导 清华大学出版社 2003 年实验一1、 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察（学时）一、教学基本要求：1. 掌握植物染色体压片法。2. 掌握有丝分裂各时期的特征。3. 掌握用秋水仙素诱发多倍体的一般方法二、教学内容：1、 洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察目的和要求本次实验通过对植物根尖的制片和观察

4、, 要求学生初步学会对植物组织、细胞的固定、离析和压片方法，了解有丝分裂的全过程及其染色体的动态变化情况,掌握有丝分裂各时期的特征。实验原理有丝分裂是细胞均等增殖的过程, 是体细胞分裂的主要方式.在有丝分裂过程中.细胞内每条染色体都能复制一份, 然后分配到子细胞中,因此两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目,形态和性质上均是相同的，在各种生长旺盛的植物组织中均存在着有丝分裂。分生组织固定解离染色压片观察（间期、早期、中期、后期、末期） 材料和方法洋葱或大蒜或种子根尖水浴锅、显微镜卡诺氏固定液、石炭酸品红（或醋酸洋红）染色液，1N盐酸（或0.5%果胶酶+纤维素酶）,秋水仙素（0.1%）1、取材：大

5、蒜、洋葱根尖，恒温箱2、预处理：药物处理（秋水仙素）或冷冻处理（冰箱）3、固定：卡诺氏固定液4、解离： 恒温水浴锅，1N盐酸或0?5的果胶酶和纤维素酶5、染色及压片：染色液（改良苯酚品红或醋酸洋红），载玻片、盖玻片6、染色体观察：显微镜7、永久封片（示范）：二甲苯、中性树胶 步骤1、 取材：培养（预处理）切取（在分裂高峰期）2、 固定：卡诺氏固定液12-24小时70%的酒精中保存3、 解离：水洗盐酸60 8-10解离水洗4、 染色：切取分生区吸水染色液一滴，15分钟分割压片，镜检 作 业1、绘出所观察到的有丝分裂图象，并注明时期。2、预处理与未预处理的分裂相有何不同为什么？2、植物多倍体人工诱

6、导实验二果蝇的形态、生活周期及其饲养（学时）一、教学基本要求：1、 能够辨别果蝇雌雄性别及常见突变型。2、 掌握实验果蝇的饲养以及实验中的处理方法和技术。二、教学内容：目的和要求 果蝇具有生活史短、繁殖率高、饲养简便等特点, 是研究遗传学的好材料.通过这一实验 ,可以让学生了解果蝇生活史及各个阶段的形态特征,，雌雄性别特征，常见突变型的特征，掌握实验果蝇的饲养,以及实验的处理方法和技术,为果蝇的杂交实验做准备实验原理雄蝇体型较小,末端钝而圆.颜色深,腹背面有4个腹片,第一对足的跗节前端有性梳,而雌蝇体型较大,末端尖，颜色浅，腹背面的有条黑色条纹。腹面有6个腹片，无性梳。材料和方法果蝇因饲养条件

7、简单、发育时间短（25，10-12d）、染色体数目少（2n=4）、突变类型多、且多为形态突变、易观察等优点，常作为遗传学实验的首选材料。但在果蝇的培养和保种过程中，常会出现培养基长霉，且一旦培养基长霉后，果蝇身上沾满了霉菌孢子，若将此果蝇接种到新的培养基中，大约经过4-5d，培养基将会重新长出霉菌来。因此培养基长霉问题，对于培养和保种果蝇将是一件非常触手的事情。如何防止培养基长霉以及长霉后如何处理，本文将做一探讨。如何防止培养基长霉当环境温度不适应果蝇生长时（温度低于18），培养基接种后的7d内，特别容易长霉。要避免长霉，应注意：培养果蝇的器皿要严格消毒。培养瓶洗干净后，自然凉干，再与棉塞一道

8、进行高温干燥灭菌（120，30min）。培养基营养要全面。果蝇培养基的种类很多，本实验室用的是玉米培养基，配方及配料如下：水750ml煮开，加琼脂6.2g，待琼脂溶解后加白糖62.5g，搅拌溶解后加调成糊状的玉米糊（玉米82.5g，用冷水调成糊状，如直接加入开水中，易起团），煮开2-3min，加酵母粉7g，加热1-2min，搅拌均匀后，移去火源，加丙酸2ml（起杀菌防霉的作用）。培养基稍稍冷却后，倒入已灭菌的培养基瓶中，尽量不要让培养基粘在瓶壁上，塞好棉塞，放入仍有余热的干燥箱中将瓶壁上的水蒸干。接种时消好毒。在无菌室内接种，如没有无菌室，在接种前用75酒精棉球擦双手一遍。接种后，放入适宜果蝇

9、生长温度的培养箱中培养果蝇（温度20-25），一旦下一代成蝇孵出来后，培养基就不易长霉。长霉后的处理措施若培养基长霉后，由于霉菌孢子漂浮于培养瓶的整个空间，包括果蝇身上，如将此果蝇接种到新的培养基中，大约经过4-5d，培养基将会重新长出霉菌来，遇到该问题，解决的方法只有两种：一是不要这种果蝇，重新从其他人中接种未长霉的果蝇；二是采取措施杀死果蝇身上的霉菌孢子。方法为：将带有霉菌孢子的成蝇倒入空培养瓶中，棉塞上倒适量的75酒精，再将瓶口塞紧，利用酒精具有挥发性，挥发后的酒精充满整个瓶内，从而将果蝇身上的霉孢子杀死。在操作上应注意两点：一是倒在棉塞上的酒精量要合适，过多果蝇易醉昏，过少杀死不了霉菌

10、孢子；二是果蝇呆在空瓶内的时间要恰当，以2d为好。作 业1、观察比较雌雄果蝇的区别2、记下突变型的特征3、制备培养基把50或100ml的三角瓶（数目根据自己试验确定）洗干净，干燥。（能够高温灭菌也好，似乎没那必要）配培养基。培养基比例：蔗糖13g，琼脂1.5g，玉米粉17g，水（单蒸水就可以）180 ml。乙酸2 ml（可少一点），酵母粉至少1.4g培养基配制步骤：（1）称取玉米粉17g装入烧杯1（要大一些的烧杯，如500 ml），量取水90 ml。先加少量水于烧杯中，搅拌成均匀的糊状，再加入其余的水，搅拌均匀。然后一边在电炉上加热，一边搅拌。直到完全煮熟。冒泡泡以后，火小点，免得溢出来。冒泡

11、泡以后还是要再煮好一会。要充分煮熟，要不培养基在培养过程中，果蝇没有吃完就发酵了，果蝇会死的。煮好了放在一边。（2）称取蔗糖13g，琼脂1.5g装入烧杯2，量取水90 ml。加入大半水于烧杯中，一边加热一边搅拌。完全煮溶。（3）把烧杯2中煮溶的蔗糖和琼脂倒入烧杯1中，用步骤2剩余的水冲一冲烧杯，也倒入烧杯1中。（如果烧杯1小，就装不到了。）然后搅匀，继续搅拌加热，直到沸腾，充分混匀。(4) 待烧杯1稍凉。这个时候把干燥好的三角瓶摆放旁边。将至少1.4g酵母粉加入烧杯1搅匀，将培养基倒入三角瓶中（要用卖油翁的技术，这个你没问题，就是不要把培养基沾到瓶壁或周围，浪费也不好看）。（按照敬老师的说法要

12、待烧杯1凉到80度左右，我觉得稍凉就好了。因为加入酵母粉后还搅拌，就更凉了。倒入三角瓶时，到后边就太凉了有点凝固，不好倒，还会沾到瓶壁上。）（5）把倒好的培养基放到超净工作台上，放2天，等待瓶壁和培养基上的水分挥发。有水残留的话，果蝇放进去翅膀打湿，飞不起来，就翘翘了。（我自己的做法是配培养基的时候少加10ml的水，等待一天，没有完全干，但也可以用）由于果蝇是吃里面生长的酵母，所以培养基放上三天，有酵母生长了就可以接种果蝇了。（6）我自己收集果蝇的方法：放一点水果在矿泉水瓶子中，至少要四五天才会有很多果蝇。这几天的时间就赶快去准备其他的东西。培养基弄好了，就把瓶子收起来，带实验室去接种。果蝇的

13、培养条件是20-25度，25度以上的温度不好的，不记得原因了。20度以下生长慢。实验三小鼠骨髓细胞染色体标本制作（4学时）一、实验目的和要求 通过这一实验，要求学生了解哺乳动物染色体标本的制作方法，并对动物染色体进行观察。 二、实验原理 由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。 三、实验用品 1材料：小白鼠2器具：注射器（1ml,5ml）、5号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片

14、、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉花、量筒、天平、恒温水浴锅 3药品：0.01%秋水仙素、0.075MKCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)，0.85%生理盐水。 四、实验步骤 1预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml，给小白鼠腹腔注射秋水仙素。 2断颈处死动物，解剖小鼠内生殖器官，鉴别雌雄性别。 3剥取股骨，剔去肌肉组织，剪去两端的股骨头 4冲洗骨髓：吸取0.6ml生理盐水,注射器针头插入股骨一端,反复冲洗骨髓到8ml的离心管中. 5低渗：加入4.4ml0.075MKCl溶液,37oC水浴低渗40分钟，中间（约20分钟）

15、用吸管吹打一次，使细胞分散，悬浮于溶液中。 6离心：1000rpm离心10分钟后弃去上清液，离心之前加1ml固定液并用吸管轻轻吹匀，进行预固定。7固定I：沿管壁慢慢加入固定液5ml，用吸管吹打成细胞悬液后，室温下静置30分钟，15分钟时吹打一次。8离心：1000rpm离心10分钟，弃上清液。 9固定II：同固定I。 10离心：同8离心后加0.3-0.5ml固定液，吸管吹打成细胞悬液。 11滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热，室温晾干12染色：10% Giemsa染液染色30分钟； 镜检：低倍高倍 。 五、注意事项 低渗与离心等步骤的操作要轻。 观察细胞的标准为

16、：1细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。2染色体形态和分布良好。3最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。4所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。 六、作业和思考 选择染色体清晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。实验四人类常见遗传性状调查一、实验目的:了解推测（计算）基因频率和基因型频率的方法。特定基因型占群体内全部基因型的比率称为基因型频率。假设二倍体生物某一位点有一对等位基因A和a，可以有三种基因型，即AA、Aa、aa。同一座位上所有基因型频

17、率之和等于1。所谓基因频率指的是特定基因座位上某个等位基因占该座位上全部等位基因总数的比率。同一座位上全部等位基因频率之和等于1。知道了基因型频率就可求得基因频率。A基因在群体出现的频率为p，a基因在群体出现的频率为q；基因型AA在群体出现的频率为D，基因型Aa在群体出现的频率为H，基因型aa在群体出现的频率为R。群体（D，H，R）交配是完全随机的，那么这一群体基因频率和基因型频率的关系是：D=p2 H=2pq R=q2 从人类群体性状的遗传分析，可以了解不同种族（民族）的基因频率和基因型频率。性状显性隐性耳垂与脸颊分离紧贴脸颊卷舌状能不能美人尖有无拇指竖起时变曲情形挺直拇指第一节向指背弯曲食

18、指长短较无名指长较无名指短双手手指嵌合左手拇指在上右手拇指在上上眼脸有无皱褶有(双眼皮)无(单眼皮)酒窝有无人类常见遗传性状的调查分析（1）. 以10个人为一组，由小组长观察上述8个单对基因控制性状的表现，并作记录。（2）. 统计全班（年段）的资料，进行基因频率和基因型频率的计算。计算公式：D+H=p2+2pq R=q2作业：统计全班学生8种性状的基因频率和基因型频率。实验五：人类巴氏小体的观察1949年，Barr在猫神经元核仁附近发现一种染色很深的小体。仔细研究发现这种小体出现在多数雌猫神经元中，而在雄猫的神经元中则极少出现。他以更多的动物组织做了深入的研究，结果发现食肉类、偶蹄类、灵长类（

19、包括人类）等动物的不同组织的体细胞中，同样显示这种性别差异。Barr称这种小体为核仁随体（现在我们通常称之为Barr小体，性染色质小体，或X染色质。下文统称这种小体为X染色质），并推论这种小体是由性染色体的异染色质衍化来的。Barr的推论是正确的，但他并沿岸有弄清这小体竟是1条X染色体还是2条X染色体的异染色质形成的。这是因为间期的染色体在核中伸展成丝状，异染色质虽可染上较深的颜色，但无法辨别它究竟是一条染色体或仅是一条染色体或仅是染色体的一个片段。20世纪60年代前后，根据对性染色体异常病人的X染色体与X染色质数目的关系的研究发现，X染色质数等于一个个体的X染色体数减1。进一步的研究表明，一

20、个X染色质是一条异染色质化的X染色，在间期其DNA的复制要比其他的染色体晚（Morishima，1962）。在一个个体中，究竟是来自父本还是来自母本的X染色体失活，则是随机的，这种随机失活是生物体内的剂量补偿机制（LYON，M.，1962）。从上述我们可以看出X染色质是一种包含结构基因的异染色质，这种异染色质通常称为兼性异染色质（facultative chromatin）。通常用口腔粘膜、头发根鞘、外周血细胞等制备X染色质。由于取材方便，方法简单，X染色质检测广泛应用于性别畸形的诊断中。检查羊水细胞的X染色质，还可在产前诊断胎儿性别。在人类细胞中，还存在另一种异染色质小体，这就是Y染色质，Y

21、染色体在间期也呈现异固缩状态。Y染色质如何检测呢？研究发现，Y染色体长臂的远端经过荧光染料喹吖因（quinacrine）染色后，可发出明亮的荧光，这种荧光在间期细胞中表现为一个明亮的荧光点，直径约在0.3-1um。在多数情况下，其他的染色体不显荧光或不具有如此强的荧光，因此，这种荧光亮点就成了检测Y染色质的一种方法。用于制备X染色质的材料同样可用于制备Y染色质。制备两种染色质的方法有多种，Schwarzacher（1974）曾对此做过详尽的综述。在本实验中，我们将选择两种材料、两种染色方法制备并观察X染色质小体。实验材料、器具和试剂显微镜、牙签、镊子、解剖针； 载玻片（要非常干净，这样材料才能

22、粘得比较牢，这一点有用口腔粘膜上皮细胞制备X 染色质小体时尤其重要）、盖玻片。记号笔、镜头纸； 固定液（95%酒精：冰醋酸=3：1，盛在染色缸中）、蒸馏水； 70%、95%酒精、无水酒精、45%醋酸、5mol/L HCl； 二甲苯、香柏油（将两者装在双层瓶中）； 硫堇（thionine）或卡宝品红染液（装于滴瓶中）。实验步骤 1 获取实验材料 A.口腔黏膜细胞 取一干净的载玻片，用记号笔在即将涂细胞的一面作个标记。先用水将口漱净，尽可能除去口中的杂物。然后用牙签钝头在口腔一侧用力刮取，弃去第一次得到的刮取物，在同一部位继续刮取（这样就可取得深层的表皮细胞），将刮得的细胞涂抹在干净载玻片上，反复

23、几将从，使玻片上的材料尽量厚些。 勿令玻片上的材料干燥，迅速将玻片插入装固定液的染色缸中固定30分钟以上。如果让材料在空气中干燥，会使细胞变形。拿刚涂抹的玻片直接插入固定液中，当然会使许多材料丢失，但粘在玻片面性上的细胞足够观察之需。固定后将载玻片在空气中晾干，这样，细胞就可以紧贴在玻片的表面。 B.毛囊细胞（Hair follicle cell） 拔取一根毛根比较大的毛发（头发或其他部位，如手臂上的毛发均可；如可能，尽量选用白色或浅颜色的毛发，这样在制片中就可减少色素的干扰）。在一张干净的载玻片中央滴一滴45%的醋酸，将毛根浸渍其中。静置约5分钟，待毛根稍软后用镊子尖或解剖针尖将外层毛囊的组

24、织细胞轻轻刮下（用力太大，则可能将毛发上的色素细胞一起刮下，影响制片效果）。弃去毛干。用解剖针将载玻片上的组织细胞均匀摊平。摊平的材料在空气中晾干。 2 染色 卡宝品红染色 1在晾干的玻片上直接滴上染料，染色10分钟。 2在95%的酒精中分色1-3分钟。 3在无水酒精中继续分色两次，每次1分钟。 4用二甲苯透明两次，每次约3分钟，直接加盖玻片封片（或用树胶封片）后观察。 3 观察 观察X染色质要用油镜。 结果辨析 在光学显微镜下可见到X染色质为一结构致密、轮廓清楚染色较深的小体。人类的X染色质常附着于核膜内侧，这个位置就是晚复制的X染色体所处的位置（Morishima,1962）。大小约在1m

25、左右，呈三角形、卵形、短棒形或者双球形。一般说来，在动物细胞中，X染色质可以处于三个位置：靠近核仁，靠近核膜，或者自由地处于核区内。这种位置，对于每一种来说是相对固定的。 处于核膜内侧的X染色质在压片时完全可能被压在核的中央。这种情形下，X染色质容易与核中其他的着色的结构相混。为保险计，我们通常只计数接近于核膜的小体。 还应注意一个问题，并非在所有的正常女性细胞中都能看到巴氏小体，用正常女性的组织制片，统计200-400个没有破损、形态正常的细胞，可观察到具巴氏小体的细胞比率约在30%-50%。但这一比率在不同实验之间差异较大。 Barr发现性染色质时，用的实验材料是猫的神经元细胞。要制备这种

26、片子程序较复杂。我们是否可以用猫的体毛做材料重复一下他的实验呢？另外，大鼠、小鼠等常用的实验动物，试试看，我们是否可能用同样的方法将“先生”与“女士”区分开？ 选做1：果蝇唾腺染色体制片技术（学时） 一、教学基本要求：1、 学习果蝇幼虫唾腺染色体的制片方法。2、 了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征二、教学内容：目的和要求要求学生掌握果蝇等幼虫唾腺剥取的技术和制作唾腺染色体标本的方法，观察掌握多线染色体的特征.实验原理果蝇唾腺染色体是处于体细胞同源染色体的配对状态，由于多次复制而不分开，因而形成具有1000-4000根染色体丝的巨大染色体,又称为多线染色体.，本实验利用剖离果蝇三龄幼虫的唾腺

27、,，压制染色体玻片标本的方法，观察多线染色体的特征。材料和方法1、实验材料：大果蝇三龄幼虫2、实验方法：用解剖针、双筒解剖镜剥取果蝇唾腺，醋酸洋红染色，染色10分钟后压片观察，制作玻片标本。作 业绘制所观察到的唾腺染色体图，制作唾腺染色体永久玻片标本。 选作2:遗传学试验的计算机模拟（学时）一、教学基本要求：了解用计算机模拟遗传学试验的原理和方法。二、教学内容：实验目的1、要求学生了解用计算机模拟遗传学试验的原理和方法。2、通过对自由组合规律和连锁交换规律的模拟，要求学生掌握不同群体大小、不同重组值大小对试验结果的影响。3、通过对遗传漂变的计算机模拟，要求学生掌握群体的大小对群体基因频率和基因

28、型频率的影响实验原理1、许多遗传学实验具有随机性。2、利用计算机运算速度快的特点可模拟大量的遗传学试验。3、利用随机函数产生符合一定分布的配子、合子。材料和方法1、设备：计算机及其计算机模拟软件（学生可自己编制）。2、自由组合规律的模拟：分别选样本数为50、200，400，试验次数为100次的情况下，F2代四种表型的3、连锁遗传的计算机模拟：样本数分别选为50、200，400，重组值分别取20，30，40，每种情况分别模拟100次。4、漂变的计算机模拟：模式二，试验群体数为3，每个群体的大小分别选取50，200，1000。作业根据以上计算机模拟试验的结果，分析试验群 体的大小、重组值的大小对双因子遗传试验的影响， 不同群体的大小对群体基因频率和基因型频率的影响。总结出在双因子遗传学试验中应注意哪些问题。-