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1、 第六章 核 酸 提要 一.概述核酸分类 分布与功能 二.核苷酸碱基 嘌呤与嘧啶 DNA与RNA中的核苷与核苷酸 多磷酸核苷酸 环核苷酸三.DNA的结构磷酸二酯键 DNA的一级结构 DNA的二级结构 DNA的三级结构 DNA的拓扑结构四.RNA的结构DNA与RNA的区别 RNA的种类与功能 tRNA的结构特点 mRNA的结构特点五.核酸的理化性质紫外吸收 DNA的变性与复性 限制性内切酶 第一节 概述一发现核酸占细胞干重的515，1868年被瑞士医生Miescher发现，称为“核素”。在很长时间内，流行“四核苷酸假说”，认为核酸是由等量的四种核苷酸构成的，不可能有什么重要功能。1944年Osw
2、ald Avery通过肺炎双球菌的转化实验首次证明DNA是遗传物质。正常肺炎双球菌有一层粘性发光的多糖荚膜，有致病性，称为光滑型（S型）；一种突变型称为粗糙型（R型），无荚膜，没有致病能力（缺乏UDP-葡萄糖脱氢酶）。1928年，格里菲斯发现肺炎双球菌的转化现象，即将活的粗糙型菌和加热杀死的光滑型菌混合液注射小鼠，可致病，而二者单独注射都无致病性。这说明加热杀死的光滑型菌体内有一种物质使粗糙型菌转化为光滑型菌。艾弗里将加热杀死的光滑型菌的无细胞抽提液分级分离，然后测定各组分的转化活性，于1944年发表论文指出“脱氧核糖型的核酸是型肺炎球菌转化要素的基本单位”。其实验证据如下：1.纯化的、有高度
3、活性的转化要素的化学元素分析与计算出来的DNA组成非常接近。2.纯化的转化要素在光学、超速离心、扩散和电泳性质上与DNA的相似。3.其转化活性不因抽取去除蛋白质或脂类而损失。4.用胰蛋白酶和糜蛋白酶处理不影响其转化活性。5.用RNA酶处理也不不影响其转化活性。6. DNA酶可使其转化活性丧失。艾弗里的论文发表后，有些人仍然坚持蛋白质是遗传物质，认为他的分离不彻底，是混杂的微量的蛋白质引起的转化。1952年，Hershey和Chase的T2噬菌体旋切实验彻底证明遗传物质是核酸，而不是蛋白质。他们用35S标记蛋白质，用32P标记核酸。用标记的噬菌体感染细菌，然后测定宿主细胞的同位素标记。当用硫标记
4、的噬菌体感染时，放射性只存在于细胞外面，即噬菌体的外壳上；当用磷标记的噬菌体感染时，放射性在细胞内，说明感染时进入细胞的是DNA，只有DNA是连续物质，所以说DNA是遗传物质。1956年，Fraenkel Conrat的烟草花叶病毒（TMV）重建实验证明，RNA也可以作为遗传物质。把TMV在水和酚中震荡，使蛋白质与RNA分开，然后分别感染烟草，只有RNA可以使烟草感染，产生正常后代。1953年DNA的双螺旋结构模型建立，被认为是本世纪自然科学的重大突破之一。由此产生了分子生物学、分子遗传学、基因工程等学科和技术，此后的30年间，核酸研究共有15次获得诺贝尔奖，占总数的1/4，可见核酸研究在生命
5、科学中的重要地位。二、核酸的分类核酸是由核苷酸组成的大分子，分子量最小的是转运RNA，分子量25kd左右；人类染色体DNA分子量高达1011kd。核酸分为DNA和RNA两类，DNA主要集中在细胞核中，在线粒体和叶绿体中也有少量DNA。RNA主要分布在细胞质中。对病毒来说，或只含DNA，或只含RNA。因此可将病毒分为DNA病毒和RNA病毒。核酸可分为单链（single strand，ss）和双链（double strand，ds）。DNA一般为双链，作为信息分子；RNA单双链都存在。第二节 核苷酸一、核苷酸的结构核苷酸可分解成核苷和磷酸，核苷又可分解为碱基和戊糖。因此核苷酸由三类分子片断组成。戊
6、糖有两种，D-核糖和D-2-脱氧核糖。因此核酸可分为两类：DNA和RNA。（一）碱基（base）核酸中的碱基分为两类：嘌呤和嘧啶。1.嘧啶碱（pyrimidine,py） 是嘧啶的衍生物，共有三种：胞嘧啶(cytosine,Cyt)、尿嘧啶(uracil,Ura)和胸腺嘧啶(thymine,Thy)。其中尿嘧啶只存在于RNA中，胸腺嘧啶只存在于DNA中，但在某些tRNA中也发现有极少量的胸腺嘧啶。胞嘧啶为两类核酸所共有，在植物DNA中还有5-甲基胞嘧啶，一些大肠杆菌噬菌体核酸中不含胞嘧啶，而由5-羟甲基胞嘧啶代替。因为受到氮原子的吸电子效应影响，嘧啶的2、4、6位容易发生取代。2.嘌呤碱(pu
7、rine,pu) 由嘌呤衍生而来，常见的有两种：腺嘌呤(adenine,Ade)和鸟嘌呤(guanine,Gua)。嘌呤分子接近于平面，但稍有弯曲。自然界中还有黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、茶叶碱、可可碱和咖啡碱。前三种是嘌呤核苷酸的代谢产物，是抗氧化剂，后三种含于植物中，是黄嘌呤的甲基化衍生物，具有增强心脏功能的作用。此外，一些植物激素，如玉米素、激动素等也是嘌呤类物质，可促进细胞的分裂、分化。一些抗菌素是嘌呤衍生物。如抑制蛋白质合成的嘌呤霉素，是腺嘌呤的衍生物。生物体中（A+T）/（G+C）称为不对称比率，不同生物有所不同。比如人的不对称比率为1.52，酵母为79，藤黄八叠球菌为0.35。3.稀
8、有碱基 除以上五种基本的碱基以外，核酸中还有一些含量极少的稀有碱基，其中大多数是甲基化碱基。甲基化发生在核酸合成以后，对核酸的生物学功能具有重要意义。核酸中甲基化碱基含量一般不超过5，但tRNA中可高达10。（二）核苷核苷是戊糖与碱基缩合而成的。糖的第一位碳原子与嘧啶的第一位氮原子或嘌呤的第九位氮原子以糖苷键相连，一般称为N-糖苷键。戊糖是呋喃环，C1是不对称碳原子，核酸中的糖苷键都是糖苷键。碱基与糖环平面互相垂直。糖苷的命名是先说出碱基名称，再加“核苷”或“脱氧核苷”。在tRNA中含有少量假尿嘧啶核苷（用表示），它的核糖与嘧啶环的C5相连。规定用三字母符号表示碱基，用单字母符号表示核苷，前面
9、加d表示脱氧核苷。戊糖的原子用带的数字编号，碱基用不带的数字编号。（三）核苷酸核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸。核糖核苷的糖环上有三个羟基，可形成三种核苷酸：2、3和5-核糖核苷酸。脱氧核糖只有3和5两种。生物体内游离存在的多是5核苷酸。用碱水解RNA可得到2和3核糖核苷酸的混合物。稀有碱基也可形成相应的核苷酸。在天然DNA中已找到十多种脱氧核糖核苷酸，在RNA中找到了几十种核糖核苷酸。（四）多磷酸核苷酸细胞内有一些游离的多磷酸核苷酸，它们具有重要的生理功能。5-NDP是核苷的焦磷酸酯，5-NTP是核苷的三磷酸酯。最常见的是5-ADP和5-ATP。ATP上的磷酸残基由近向远以编号。外侧
10、两个磷酸酯键水解时可释放出7.3千卡能量，而普通磷酸酯键只有2千卡，所以被称为高能磷酸键（P）。因此ATP在细胞能量代谢中起极其重要的作用，许多化学反应需要由ATP提供能量。高能磷酸键不稳定，在1NHCl中，100水解7分钟即可脱落，而磷酸则稳定得多。利用这一特性可测定ATP和ADP中不稳定磷的含量。细胞内的多磷酸核苷酸常与镁离子形成复合物而存在。GTP,CTP,UTP在某些生化反应中也具有传递能量的作用，但不普遍。UDP在多糖合成中可作为携带葡萄糖的载体，CDP在磷脂的合成中作为携带胆碱的载体。各种三磷酸核苷酸都是合成DNA或RNA的前体。鸟嘌呤核苷四磷酸酯和五磷酸酯在代谢调控中起作用，在大
11、肠杆菌中，它们参与rRNA合成的控制。（五）环化核苷酸磷酸同时与核苷上两个羟基形成酯键，就形成环化核苷酸。最常见的是3,5-环化腺苷酸(cAMP) 和cGMP。它们是激素作用的第二信使，起信号传递作用。可被磷酸二酯酶催化水解，生成相应的5-核苷酸。二、有关缩写符号碱基用三字母符号表示，核苷用大写单字母符号表示，前面加d表示脱氧核苷。戊糖的原子用带的数字编号，碱基用不带的数字编号。稀有核苷（修饰核苷）也用单字母符号表示，如D表示二氢尿嘧啶核苷，T表示胸苷。如果碱基上有修饰基团，就在表示核苷的大写字母前加上代表修饰基团的小写字母，在这个小写字母的右上方写明修饰位置，右下方写明修饰基团的数量（如只有
12、一个可省略）。如m2G表示2-N-甲基鸟苷，m2，2，73G表示N2,N2,7-三甲基鸟苷，S4U表示4-硫代尿苷。核糖上的修饰基团写在表示核苷的大写字母右边，如Cm表示2-O-甲基胞苷。核苷酸可在核苷符号旁加小写p表示，写在左边表示5核苷酸，写在右边表示3核苷酸。写几个就表示几个磷酸。3,5-环化核苷酸可在前面加小写c，2,3-环化核苷酸可在核苷符号后加P，如UP表示2,3-环化尿苷酸。三、核苷酸的功能1.作为核酸的成分。2.为需能反应提供能量。UTP用于多糖合成，GTP用于蛋白质合成，CTP用于脂类合成，ATP用于多种反应。3.用于信号传递。如cAMP、cGMP是第二信使。4.参与构成辅酶
13、。如NAD、FAD、CoA等都含有AMP成分。5.参与代谢调控。如鸟苷四磷酸等可抑制核糖体RNA的合成。又如反义RNA。第三节 DNA的结构一、DNA的一级结构1.定义DNA是由成千上万个脱氧核糖核苷酸聚合而成的多聚脱氧核糖核酸。它的一级结构是它的构件的组成及排列顺序，即碱基序列。2.结构在DNA分子中，相邻核苷酸以3，5磷酸二酯键连接构成长链，前一个核苷酸的3羟基与后一个核苷酸的5磷酸结合。链中磷酸与糖交替排列构成脱氧核糖磷酸骨架，链的一端有自由的5磷酸基，称为5端；另一端有自由3羟基，称为3端。在DNA中，每个脱氧核糖连接着碱基，碱基的特定序列携带着遗传信息。3.书写书写DNA时，按从5向
14、3方向从左向右进行，并在链端注明5和3，如5pApGpCpTOH3。也可省略中间的磷酸，写成pAGCT。这是文字式缩写。还有线条式缩写，用竖线表示戊糖，1在上，5在下。二、DNA的二级结构（一）双螺旋结构的建立DNA双螺旋结构的阐明，是本世纪最重大的自然科学成果之一。在40年代，人们已经发现脱水DNA的密度很高，X射线衍射表明DNA中有0.34nm和3.4nm的周期性结构。1950年，Chargaff通过对碱基的分析发现了互补配对规律：在任何DNA中，A=T，G=C，所以有A+G=T+C。1953年Watson和Crick根据Wilkins的DNAX-射线衍射数据和碱基组成规律，建立了DNA的
15、双螺旋结构模型，从而揭开了现代分子生物学的序幕。当年Watson只有24岁，在剑桥Cavendish实验室进修，他在美国时就认识到核酸的重要性，所以在大家都在研究蛋白质时致力于核酸研究，从而得到了划时代的成果。Watson和Crick阐明的是B-DNA结晶的结构模型，与细胞内存在的DNA大体一致。近年来又发现，局部DNA还可以其他双螺旋或三螺旋的形式存在。（二）B-DNA双螺旋结构的要点1.基本结构DNA双螺旋是由两条反向、平行、互补的DNA链构成的右手双螺旋。两条链的脱氧核糖磷酸骨架反向、平行地按右手螺旋走向，绕一个共同的轴盘旋在双螺旋的外侧，两条链的碱基一一对应互补配对，集中地平行排列在双
16、螺旋的中央，碱基平面与轴垂直。DNA双螺旋中的两条链互为互补链。2.基本数据双螺旋外径2nm，螺距3.4nm，每10对碱基上升一圈。因此每对碱基距离0.34nm，夹角36度。3. 作用力有两种作用力稳定双螺旋的结构。在水平方向是配对碱基之间的氢键，A=T对形成两个氢键，GC对形成三个氢键。这些氢键是克服两条链间磷酸基团的斥力，使两条链互相结合的主要作用力。在垂直方向，是碱基对平面间的堆积力。堆积力是疏水力与范德华力的共同体现。氢键与堆积力两者本身都是一种协同性相互作用，两者之间也有协同作用。4.大小沟脱氧核糖磷酸骨架并未将碱基对完全包围起来，在双螺旋表面有两个与双螺旋走向一致的沟，一个较深较宽
17、，称大沟；一个较窄较浅，称小沟。大沟一侧暴露出嘌呤的C6、N7和嘧啶的C4、C5及其取代基团；小沟一侧暴露出嘌呤的C2和嘧啶的C2及其取代基团。因此从两个沟可以辨认碱基对的结构特征，各种酶和蛋白因子可以识别DNA的特征序列。5.修正以上模型是DNA的平均特征，由于碱基序列的影响，在局部会有所差异。如两个核苷酸之间的夹角可以从28度到42度不等，互补配对的碱基之间有一定夹角，称为螺旋桨状扭曲。螺旋一圈含有10.4个碱基对。（三）DNA的其他结构DNA纤维在92的相对湿度下可形成B-DNA。DNA钠盐、钾盐或钙盐在75的相对湿度下可形成A型结构，它也是右手螺旋，但碱基略有倾斜（19度），螺距和骨架
18、结构也稍有不同，每匝11个碱基对，短粗。其生物学意义在于它与双链RNA及DNA-RNA杂合体在溶液中的构象极其相似。由于2羟基的存在，RNA不易采取B型构象，所以在转录时，DNA要采取A型构象。一些有机溶剂和蛋白质可将B型DNA变成A型构象。在66相对湿度的DNA锂盐纤维中发现有C型结构。可以认为C型构象在浓盐溶液和乙二醇溶液中发生。此时堆积力降低，氢键结合能量相对增加。C型结构也是右手螺旋，存在于染色质和某些病毒中。此外还有D型及被称为T和P的两种亚稳态结构。富含A-T对的DNA区域有较大的结构多样性。DNA还有左手螺旋，即Z-DNA。其骨架呈锯齿走向，在嘌呤与嘧啶交替排列的寡聚DNA中发现
19、，也是反平行互补的双螺旋，每匝12个碱基对，螺旋细长。这说明DNA的碱基序列不仅储存遗传信息，也储存了自身高级结构的信息。Z-DNA作为特殊的结构标志，与基因表达的调控有关。三、DNA的三级结构（一）超螺旋DNA的三级结构是指双螺旋的进一步扭曲。其基本形式是超螺旋，即螺旋的螺旋。三级结构决定于二级结构。B-DNA以每10个碱基一圈盘绕时能量最低，处于伸展状态；当盘绕过多或不足时，就会出现张力，形成超螺旋。盘绕过多时形成正（右手）超螺旋，不足时为负超螺旋。因为超螺旋是在双螺旋的张力下形成的，所以只有双链闭合环状DNA和两端固定的线形DNA才能形成超螺旋，有切口的DNA不能形成超螺旋。无论是真核生
20、物的双链线形DNA，还是原核生物的双链环形DNA，在体内都以负超螺旋的形式存在，密度一般为100200bp一圈。DNA形成负超螺旋是结构与功能的需要。（二）高级结构的动态变化在细胞内DNA的高级结构是变化的。通过多种蛋白因子和酶的作用，改变DNA的二级结构和三级结构，是生物功能的需要。DNA的复制、转录、重组、修复，都伴随着其高级结构的变化。在生物体内，改变高级结构有以下三种方法：在解链酶的作用下，破坏碱基对间的氢键，使DNA局部解链成为单链区，以增加未解链的双链区的盘绕数，从而增加正超螺旋或减少负超螺旋。通过局部形成Z-DNA（左手）双螺旋，也可增加B-DNA部分的盘绕数，减少负超螺旋。通过
21、拓扑异构酶切断DNA的一条或两条链，在双螺旋张力的推动下，使断端绕互补链旋转，释放张力后再连接，可消除超螺旋，也可引入超螺旋。DNA的拓扑结构有公式如下：L=T+W其中L称为连环数，是一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，必须是整数。缠绕数T是双螺旋周数，W是超螺旋数。T、W可以是小数。超螺旋密度一般在-0.03到-0.09之间。（三）超螺旋的多层次性真核生物的染色体是DNA与蛋白质的复合体，其中DNA的超螺旋结构是多层次的。染色体由染色质细丝经过多次卷曲而成。染色质细丝由核小体重复单位构成串珠状结构。核小体由DNA和组蛋白组成。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白，有H1、H2A、H2B、H
22、3和H4共5种。后四种各2分子组成核小体的蛋白核心，约140bp双螺旋DNA（核心DNA）在蛋白核心外绕行1.75圈，共同构成核小体的核心颗粒。核心颗粒之间有约60bp的连接DNA。1分子组蛋白H1结合在连接DNA的进出部位，将核心DNA固定在核心蛋白外围。核小体呈扁球形，高约6nm，直径约11nm。由核心DNA与连接DNA构成的核小体重复单位包括约200bp，长度由68nm压缩至11nm。所以第一次超螺旋使直径2nm的DNA双螺旋变成直径11nm的染色质细丝，长度压缩67倍。染色体细丝经过再一次超螺旋，形成直径30nm的染色体粗丝，长度又压缩6倍。第三次超螺旋使粗丝盘绕成直径400nm的单位
23、纤维，长度压缩40倍。最后由单位纤维折叠形成染色单体，长度压缩45倍。这样，经过4次超螺旋，DNA的长度压缩了近万倍（8400倍）。第四节 RNA的结构一、RNA的结构特点1. RNA分子是一条单链。可以回折，自身互补配对，形成发夹或称为茎环结构。形成局部A螺旋至少要有4-6个碱基对。某些分子中回折可占50%。2. RNA分子中的核糖有2-羟基，但不用于成键。3.以尿嘧啶代替胸腺嘧啶，含有多种稀有碱基。4. RNA是DNA部分序列的转录产物，分子量小得多。有些病毒含有RNA复制酶，可以催化以RNA为模板的RNA合成，即RNA的复制。5. RNA是多拷贝的。6.RNA按功能分为三类：转运RNA(
24、tRNA)、信使RNA(mRNA)和核糖体RNA(rRNA)。此外还有snRNA和hnRNA。前者与RNA的加工有关，后者是mRNA的前体。二、转运RNA（一）一级结构转运RNA是小分子，一般由7493个核苷酸构成，分子量在25kd上下，沉降系数4s。其功能是转运氨基酸，按照信使RNA的碱基序列合成蛋白质。20种氨基酸都有专一的转运RNA，有的还有2种或多种转运RNA。原核生物有3040种tRNA，真核生物有5060种或更多。有报道说有一种RNA(tRNASer)可专一转运硒代半胱氨酸，可识别UGA（终止密码）。tRNA是修饰成分最多的核酸。已经发现的约70种修饰成分中，有50种存在于tRNA
25、中。每个tRNA分子都有修饰成分，有的多达十几个，占全部构件的20。修饰成分包括修饰碱基和修饰核苷，都是转录后由4种标准碱基或核苷加工修饰而成的。在tRNA分子中，修饰碱基主要是甲基化碱基，修饰核苷主要是假尿嘧啶核苷。（二）tRNA的二级结构单链的RNA借部分序列互补结合，可以形成确定的二级结构。维持二级结构的作用力也是氢键和堆积力。RNA分子二级结构的基本单元是发夹结构。RNA链通过自身回折，两段互补序列配对形成一段双螺旋，两段之间未配对的碱基形成突环。由双螺旋和突环(loop)构成了发夹结构(hair pin)。回折比例高，结构稳定。tRNA分子都有由一个臂和三个发夹构成的三叶草形二级结构
26、。tRNA链的5端与3端序列构成的双螺旋区称为氨基酸臂，其3末端都有不变的单链CCAOH，因末端A结合氨基酸而得名。三个发夹依次由二氢尿嘧啶环(DHU loop)与DHU茎、反密码子环与反密码子茎、TC环与TC茎组成。反密码子环中央的三个碱基构成反密码子，与信使RNA的密码子配对。有些tRNA在反密码子茎与TC茎之间有一个额外的、长度不一的可变茎。（三）tRNA的三级结构tRNA分子在二级结构的基础上进一步扭曲形成确定的三级结构。各种tRNA的三级结构都象一个倒置的L。分子的右上端是氨基酸臂，下端是反密码子。两端距离约8nm。不同tRNA的精细结构不同，能被专一的氨基酸tRNA连接酶和有关的蛋
27、白因子识别。三、核糖体RNA高等动物核糖体有4种rRNA成分：18s、28s、5.8s、5s，他们与80多种蛋白质共同构成真核生物的核糖体（80s）。核糖体可分解为大小两个亚基，小亚基（40s）由18s rRNA和33种蛋白构成，大亚基由28s、5s、5.8s rRNA和49种蛋白构成。原核生物核糖体（70s）由三种rRNA与50多种蛋白质构成，大亚基（50s）包括23s、5s rRNA和34种蛋白，小亚基（30s）包括16s rRNA和21种蛋白。多种rRNA的一级结构已经测出。rRNA只含少量修饰成分，主要是甲基化核苷酸，包括m7G、m6G等修饰碱基和各种2-O-甲基修饰核苷。同种rRNA
28、的二级结构具有共同特点。四、信使RNAmRNA作为指导合成蛋白质的模板，具有种类多、拷贝少、寿命短、修饰成分少的特点。mRNA的主体序列是编码区，在其上游5侧和下游都有非编码区。真核生物mRNA分子两端还有5帽子和3尾部结构。原核细胞一般没有尾，某些真核病毒有。最简单的帽子结构是掉转方向的7甲基鸟苷三磷酸，它与mRNA原来的5端核苷酸借5ppp5连接形成m7GpppN。较复杂的帽子结构在后面的一个或两个核苷酸还有2-O-甲基修饰。帽子结构的通式可写为m7GpppN(m)pN(m)。帽子结构对稳定mRNA及其翻译具有重要意义，它将5端封闭起来，可免遭核酸外切酶水解；还可作为蛋白合成系统的辨认信号
29、，被专一的蛋白因子识别，从而启动翻译过程。5非编码区是帽子与编码区起始密码子之间的一段较短的序列，其中包括标志翻译起始的序列，如原核生物的SD序列。编码区由起始密码子AUG开始，到终止密码子(UAG、UGA、UAA)截止，编码一种蛋白质的一级结构。其中每三个碱基构成一个密码子，编码一个氨基酸。3侧非编码区是终止密码子以后的转录序列，其中包括AAUAAA一段序列，可能是添加3尾的标志，也可能是翻译终止的协调信号。3端尾部是一段多聚A尾。成熟的mRNA一般在它的3端都加上了长度为20200碱基的多聚A尾，作为核膜孔转运系统的标志，与成熟的mRNA通过核膜孔被运到胞浆有关。第五节 核酸的理化性质一、
30、粘度大分子溶液比普通溶液粘度大，线形大分子又比球形大分子粘度大。DNA是线形大分子，人类二倍体DNA总量3.3109bp，全长可达1.75米，DNA分子平均长度在4cm以上，而双螺旋直径只有2nm，长度与直径之比高达107。因此，DNA粘度极高，也极易在机械力作用下折断。双链DNA解链成为单链DNA时，由较伸展的双螺旋变成较紧凑的线团结构，粘度明显下降。RNA因为分子量小，且呈线团结构，所以其粘度低得多。二、密度利用密度梯度离心可以测定大分子的浮力密度。CsCl溶解度大，可制成8M溶液。DNA的浮力密度一般在1.7以上，RNA为1.6，蛋白质为1.35-1.40。分子量相同结构不同的DNA沉降
31、系数不同，线形双螺旋DNA、线形单链DNA、超螺旋DNA沉降系数之比为1:1.14:1.4。因此通过测定沉降系数可以了解DNA的结构及其变化。三、紫外吸收嘌呤和嘧啶因其共轭体系而有 强紫外吸收。核酸在260nm有紫外吸收峰，蛋白质在280nm。利用紫外吸收可测定核酸的浓度和纯度。一般测定OD260/OD280，DNA=1.8，RNA=2.0。如果含有蛋白质杂质，比值明显下降。不纯的核酸不能用紫外吸收法测定浓度。紫外吸收改变是DNA结构变化的标志，当双链DNA解链时碱基外露增加，紫外吸收明显增加，称为增色效应。双链、单链DNA与核苷酸的紫外吸收之比是1:1.37:1.6。四、DNA的变性在一定条
32、件下，双链DNA解链变成单链DNA的现象称为变性或熔化。加热引起的变性称为热变性；碱性条件（pH11.3）下，DNA发生碱变性。此外，尿素、有机溶剂、甚至脱盐都可引起DNA变性。除去变性因素后，互补的单链DNA又可以重新结合为双链DNA，称为复性或退火。DNA复性由局部序列配对形成双链核心的慢速成核反应开始，然后经过快速的所谓拉链反应而完成。DNA变性后粘度降低，密度和吸光度升高。变性后的单链DNA与具有同一性序列的DNA链或RNA分子结合形成双链的DNADNA或DNARNA杂交分子的过程称为杂交或分子杂交。分子杂交技术的发展和应用，对分子生物学和生物高技术的发展起到了重要的推动作用。通常将5
33、0%DNA分子变性时的温度称为熔点（Tm）。一般DNA在生理条件下的熔点在85-95度之间。熔点主要取决于碱基组成，G-C对含量越高，熔点越高。一般G-C对含量40%时熔点是87度，每增加1%，熔点增加约0.4度。离子强度也有影响，因为离子能与DNA结合，使其稳定，所以离子强度越低，熔点越低，熔解范围越窄。因此DNA应保存在高盐溶液中。如果DNA不纯，则变性温度范围也会扩大。甲酰胺可以使碱基对之间的氢键不稳定，降低熔点。所以分子生物实验中经常用甲酰胺使DNA变性，以避免高温引起DNA断裂。乙醇、丙酮、尿素等也可促进DNA变性。DNA的复性速度与其初始浓度C0及复杂度有关。当温度、离子强度等其他
34、条件固定时，一半DNA复性时的C0t值只与其复杂度有关，可用来计算基因组的复杂度。五、限制性内切酶限制性内切酶II识别并切割特定的回文序列，生物体用来防止外源DNA的影响，在基因工程中用于DNA的切割，被称为分子手术刀。如EcoRI，E是属名，co是种名，R是菌株名，I是发现次序。六、核酸的提纯提取：一般先破碎细胞，得到DNP或RNP。然后用酚-氯仿除蛋白，用乙醇或异丙醇将核酸沉淀出来，干燥后再溶解即可。纯化：常用电泳或层析。PAGE一般用于分离1K以下的核酸，如测序。较大的要用琼脂糖电泳。纯化mRNA常用oligo-dT的层析柱或磁珠。目前核酸研究的特点八十年代以后，核酸研究有以下特点：1.
35、 RNA研究受到重视。以前的研究以DNA为重点，现在RNA成为研究热点。核糖酶的发现和RNA的加工编辑机制是两大发现。一个基因在不同组织或不同生理状态下，从不同转录起始位点开始转录，通过不同的剪接方式和不同的3端成熟机制，可形成不同的蛋白质，这是一种比基因重排更灵活的调控方式。RNA的应用也日益广泛，如用ribozyme切割病毒核酸，用反义RNA阻断有害基因的表达等。因此，有人称90年代为RNA的十年。2.研究材料从原核走向真核。真核生物的复制、转录、翻译都比原核复杂得多，材料的改变导致了ribozyme、RNA的剪接、编辑等重大发现，大大推动了核酸的研究。3.研究核酸与核酸、核酸与其他生物大
36、分子的相互作用。生物体内的核酸多数处于各种复合物中，其结构与功能都与复合物相关。真核基因转录调控的研究主要集中在顺式作用元件（cis-acting elements）、反式作用因子（trans-acting factor）、以及它们之间的相互作用上。核糖体的结构与功能、氨酰tRNA的合成一直是研究核酸与蛋白质相互作用的两个重要对象，近来又形成剪接体（spliceo-some）、核不均一核糖核蛋白体（hn-RNP）、核小分子核糖核蛋白体（snRNP）、编辑体（editosome）等研究热点。研究进入分子水平与整体水平相结合的阶段。比如果蝇的发育受调控基因网络的控制，一些实验室正在以整体与分子水平
37、相结合的方式进行研究。 本 章 名 词 解 释 核苷（nucleoside）：是嘌呤或嘧啶碱通过共价键与戊糖连接组成的化合物。核糖与碱基一般都是由糖的异头碳与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9之间形成的-N-糖键连接。核苷酸（uncleoside）：核苷的戊糖成分中的羟基磷酸化形成的化合物。cAMP(cycle AMP)：3,5-环腺苷酸，是细胞内的第二信使，由于某部些激素或其它分子信号刺激激活腺苷酸环化酶催化ATP环化形成的。磷酸二脂键（phosphodiester linkage）:一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。该酯键成了两个醇之间的桥梁。例如一个核苷的3羟基与别一
38、个核苷的5羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二脂键。脱氧核糖核酸（DNA）：含有特殊脱氧核糖核苷酸序列的聚脱氧核苷酸，脱氧核苷酸之间是是通过3,5-磷酸二脂键连接的。DNA是遗传信息的载体。核糖核酸（RNA）：通过3,5-磷酸二脂键连接形成的特殊核糖核苷酸序列的聚核糖核苷酸。核糖体核糖核酸（Rrna,ribonucleic acid）：作为组成成分的一类 RNA，rRNA是细胞内最 丰富的 RNA .信使核糖核酸(mRNA,messenger ribonucleic acid):一类用作蛋白质合成模板的RNA .转移核糖核酸（Trna,transfer ribonucleic acid）
39、:一类携带激活氨基酸，将它带到蛋白质合成部位并将氨基酸整合到生长着的肽链上RNA。TRNA含有能识别模板mRNA上互补密码的反密码。转化（作用）（transformation）:一个外源DNA 通过某种途径导入一个宿主菌，引起该菌的遗传特性改变的作用。转导（作用）（transduction）:借助于病毒载体，遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。碱基对（base pair）:通过碱基之间氢键配对的核酸链中的两个核苷酸，例如A与T或U , 以及G与C配对 。 夏格夫法则（Chargaffs rules）：所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等（A=T），鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔含量相等（G=C），
40、既嘌呤的总含量相等（A+G=T+C）。DNA的碱基组成具有种的特异性，但没有组织和器官的特异性。另外，生长和发育阶段营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。DNA的双螺旋（DNAdouble helix）：一种核酸的构象，在该构象中，两条反向平行的多核甘酸链相互缠绕形成一个右手的双螺旋结构。碱基位于双螺旋内侧，磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二脂键相连，形成核酸的骨架。碱基平面与假象的中心轴垂直，糖环平面则与轴平行，两条链皆为右手螺旋。双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm， 两核甘酸之间的夹角是36，每对螺旋由10对碱基组成，碱基按A-T，G-C配对互补，彼此以氢键相联系。维持DN
41、A双螺旋结构的稳定的力主要是碱基堆积力。双螺旋表面有两条宽窄深浅不一的一个大沟和一个小沟。大沟（major groove）和小沟（minor groove）:绕B-DNA双螺旋表面上出现的螺旋槽（沟），宽的沟称为大沟，窄沟称为小沟。大沟，小沟都、是由于碱基对堆积和糖-磷酸骨架扭转造成的。DNA超螺旋（DNAsupercoiling）:DNA本身的卷曲一般是DNA双螺旋的弯曲欠旋（负超螺旋）或过旋（正超螺旋）的结果。拓扑异构酶（topoisomerse）:通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来改变DNA连环数的酶。拓扑异构酶、通过切断DNA中的一条链减少负超螺旋，增加一
42、个连环数。某些拓扑异构酶也称为DNA促旋酶。核小体（nucleosome）:用于包装染色质的结构单位，是由DNA链缠绕一个组蛋白核构成的。染色质（chromatin）: 是存在与真核生物间期细胞核内，易被碱性染料着色的一种无定形物质。染色质中含有作为骨架的完整的双链DNA，以及组蛋白非组蛋白和少量的DNA。染色体（chromosome）:是染色质在细胞分裂过程中经过紧密缠绕折叠凝缩和精细包装形成的具有固定形态的遗传物质存在形式。简而言之，染色体是一个大的单一的双链DNA分子与相关蛋白质组成的复合物，DNA中含有许多贮存和传递遗传信息的基因。DNA变性（DNAdenaturation）:DNA双
43、链解链，分离成两条单链的现象。退火（annealing）：既DNA由单链复性、变成双链结构的过程。来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双链结构的过程，同源DNA之间DNA和RNA之间，退火后形成杂交分子。熔解温度（melting temperature,Tm）：双链DNA熔解彻底变成单链DNA的温度范围的中点温度。增色效应（hyperchromic effect）:当双螺旋DNA熔解（解链）时，260nm处紫外吸收增加的现象。减色效应（hypochromic effect）:随着核酸复性，紫外吸收降低的现象。核酸内切酶（exonuclease）: 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶中能够水解核酸分子内
44、磷酸二酯键的酶。核酸外切酶（exonuclease）:从核酸链的一端逐个水解核甘酸的酶。限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。限制酶图谱（restriction map）:同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。反向重复序列（inverted repeat sequence）:在同一多核甘酸内的相反方向上存在的重复的核甘酸序列。在双链DNA中反向重复可能引起十字形结构的形成。重组DNA技术（recombination DNA technology）:也称之为基因工程（genomic engineering）.利用限制性内切酶和载体，按照预先设计的要求，将一种生物的某种目的基因和载体DNA重组后转入另一生物细胞中进行复制转录和表达的技术。基因（gene）:也称为顺反子（cistron）.泛指被转录的一个DNA片段。在某些情况下，基因常用来指编码一个功能蛋白或DNA分子的DNA片段。祝大家07年生物考研取得好成绩！ 学 子 272646652 55