生物化学实验指导-LSW.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date生物化学实验指导-LSW实验一 植物DNA的提取与测定实验一 植物DNA的提取与测定一、目的本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理和方法，进一步了解DNA的性质。二、原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。

2、DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例：RNP在0.14 mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4 mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法：1 CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl

3、trimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。2 SDS法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，

4、释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107109 bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几

5、乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小

6、麦黄化苗等2主要仪器（1）高速冷冻离心机 （2）751型分光光度计（3）恒温水浴（3）液氮或冰浴设备（4）磨口锥形瓶3试剂（CTAB法）（1）CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巯基乙醇。表1 CTAB提取缓冲液配制试剂名称M.W.配制1 000ml配制500mlTris121.1412.114 g6.057 gEDTA-Na2372.247.4448 g3.7224 gNaCl58.4481.816 g40.908 g用HCl调

7、pH值。（2）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。（3）DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE缓冲液中，浓度为10mg/ml，煮沸1030min, 除去DNase活性，20贮存（DNase为DNA酶，RNase为RNA酶）。（4）氯仿-异戊醇混合液（24:1，V/V）：240ml氯仿（A. R.）加10mL异戊醇（A.R.）混匀。（5）3mol/L乙酸钠（NaAc，pH6.8）：称取NaAc3H2O 81.62 g，用蒸馏水溶解，配制成200 ml，用HAc调pH至6.5。（6）无水乙醇TE缓冲液，Tris-HCl（pH

8、8.0）液，NaAc溶液均需要高压灭菌。四、操作步骤(1) DNA抽提1称取25 g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热（6065）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温，0.51 h，不时地轻轻摇动混匀。2加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。3将锥形瓶中的液体转移到离心管中，在室温下4 000 r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上清到另一干净的离心管中 (注意吸取上

9、清时不能吸入界面物质)，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。4根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。5在抽提后的上清液中加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc（pH6.8）和2倍体积的95乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。6加入1 ml 70乙醇洗涤DNA沉淀，按步骤5所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使DNA沉淀干燥。7用适量含RNase A酶（20 g/ml）的TE溶解DNA。(2) DNA含量及纯度测定1吸取5 l DNA样品，加水至1 ml，混匀后转入石英比色杯中。2分光光度计

10、先用1 ml蒸馏水校正零点。3在260 nm紫外光波长下读出光密度值，代入下式计算DNA的含量。4测OD260/ OD280值，DNA纯品的OD260/ OD280值为1.8。如果OD260/ OD280值大于1.8，说明存在RNA，可以考虑用RNA酶处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/氯仿抽提以及氯仿单独抽提，之后用乙醇沉淀纯化DNA。五、结果计算DNA浓度（g/ml）OD260稀释倍数0.020L式中OD260 为260 nm处的光密度；L为比色杯光径（cm）；0.020为1 g/ml DNA钠盐的光密度。六、附注如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到

11、4%（W/V）。在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA的得率。七、思考题1制备的DNA在什么溶液中较稳定?2为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？实验二 蛋白质的两性性质及等电点测定一、目的（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、原理蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端氨基与C端羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、

12、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：蛋白质分子阴离子 两性离子 阳离子 pH pI pH = pI pH pI电场中： 移向阳极 不移动 移向阴极 调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。三、仪器和试剂1仪器试管架；试管：15ml6；刻度吸管：1ml4，2ml4，10ml2；胶头吸管2。2试剂(1) 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.

13、05）2.875ml，加水至50ml。 (2) 0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。 (3) 0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。(4) 0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 10ml，加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。(5) 0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。(6) 0.01%溴

14、甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml。(7) 0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/L NaOH 5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。四、操作方法1蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白1ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。（2）用胶头吸管慢慢加入0.2 mol/L盐酸，边加边摇至有大量沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）继续滴加

15、0.2 mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。（4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现，继续滴加0.2 mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。解释以上(1)(4)的颜色及沉淀变化的原因。注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8 (黄色) 5.4 (蓝色)，pH4.5时开始有颜色变化。2. 酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：试剂（ml）管 号12345671.0mol/L 乙酸1.60.8000000.1mol/L 乙酸00410000.01mol/L 乙酸00002.51.250.62蒸馏水2.43.

16、2031.52.753.38溶液的pH3.53.84.14.75.35.65.9（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5 min，观察各管的混浊度。（3）用-、+、+、+等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点，最混浊一管的pH值即为酪蛋白的等电点。五、注意事项缓冲液的pH值必须准确。六、思考题1解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？实验三 双缩脲法测定蛋白质含量一、目的 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。掌握分光光度计的使用方法。二、原理 碱性溶液中双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2

17、）能与 Cu2+ 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。其可测定范围为 1- l0 mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。Tris，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。 三、器材、试剂和材料 1器材 （1) 分光光度计 （2）分析天平 （3）振荡器 （4）刻度吸管： 1 m12， 5 m12， 10 m11 （5）具塞三角瓶： 100 ml （6）漏斗： 13个 2试剂 （1）双缩脲试剂：取硫酸铜（CuSO4 5H2O）1.5g

18、和酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 4H2O） 6.0 g ，溶于500 m1蒸馏水中，在搅拌的同时加入 300 m1 10% NaOH 溶液，定容至 1000 ml ，保存于塑料试剂瓶中或内壁涂一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。 （2） 0.05 mol/L 的 NaOH 。 (3) 标准酪蛋白溶液：准确称取酪蛋白 0.5 g 溶于 0.05 mol/ L 的 NaOH 溶液中，并定容至 100 m1, 即为 5 mg/m1 的标准溶液。 3材料 小麦、玉米或其它谷物样品，风干、磨碎并通过100目铜筛。 四、操作步骤 1标准曲线的绘制 取 6 支试管，编号，

19、按下表加入试剂： 试剂管号123456标准酪蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.0H2O（ml）10.80.60.40.20双缩脲试剂（ml）444444蛋白质含量（mg）012345A 540 nm振荡15 min，室温静置 30 min，540 nm 比色，以蛋白质含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2样品测定（1）将磨碎过筛的谷物样品在 80 下烘至恒重(连续两次称重差值不超过0.5 mg)，取出置于燥器中冷却待用。 （2）称取烘干样品约 0.2 g 两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。然后在各瓶中分别加入5 ml 0.05mol/L 的NaOH溶液湿润，之后再加

20、入20 ml的双缩脲试剂，振荡15 min，室温静置反应30 min，分别过滤，取滤液在 540 nm 波长下比色，读取吸光度。在标准曲线上查出相应的蛋白质含量(mg)。 五、结果计算 六、注意事项 1三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。 2所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。 七、思考题 1. 干扰本实验的因素有哪些？2. 双缩脲法测定蛋白质含量的原理是什么?实验四 温度、pH及酶的激活剂、 抑制剂对酶活性的影响一、目的1. 巩固温度、pH值、激活剂、抑制剂对酶活性影响的认识。2. 学习测定酶的最适温度、最适pH值的简单方法，学习检测激活剂和抑制剂的方法。二、原理酶是指化学本质为蛋白

21、质的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即称为酶活性（酶活力）。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的pH即酶的最适pH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37，而其最适pH是6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性而丧失活性。酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况。唾液中含有唾液淀粉酶，淀粉在该酶的催化

22、作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘可呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈现颜色反应，如图所示：淀粉酶淀粉酶 淀粉 糊精 麦芽糖+少量葡萄糖（棕黄色，碘本身颜色）加碘后：（蓝色）（紫红色、暗褐色或红色等）三、器材和试剂1器材试管 (10 mm100 mm)；试管架；电热恒温水浴箱；沸水浴；冰浴；多孔白瓷板 (或比色盘)；滴管2试剂(1) 0.5%淀粉溶液：称取可溶性淀粉0.5 g加蒸馏水少许搅拌成糊状，然后用煮沸的1%氯化钠溶液稀释到100 ml。(2) 碘化钾碘溶液：取碘化钾2 g及碘1.

23、27 g溶解于200 ml蒸馏水中，使用前用蒸馏水稀释5倍。(3) 1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1.0 g加蒸馏水100 ml，煮沸溶解。(4) 1%CuSO4溶液：称取1 g CuSO45H2O，用蒸馏水溶解至100 ml。(5) 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 pH5.0-8.0A0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称25.62 g Na2HPO42H2O，用蒸馏水溶解后，定容至1000 ml；B0.1 mol/L柠檬酸溶液：称19.21 g 无水柠檬酸，用蒸馏水溶解后定容至1000 ml。用A、B两种溶液，按附录方法，配制pH5.0、pH6.8、pH8.0各10 ml。(6) 0.5%NaCl溶液

24、。(7) 唾液淀粉酶制备：每人用自来水漱口3次，然后取20 ml蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，稀释至40 ml为稀释唾液，供实验用。四、操作方法(一) 温度对酶活性的影响1取3支大试管，编号后按下表操作试 管 号0.5%淀粉溶液稀释唾液1温 度15 ml1 ml0水浴25 ml1 ml37水浴35 ml1 ml沸水浴2在白色比色盘上，置碘液2滴于各孔中，自试管放入水浴后，每隔1 min，从第二管中取反应液1滴与碘液混合，观察颜色变化。3待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化 (即只呈碘的颜色)时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。(二) pH对酶活性的影

25、响21取试管3支，按下表操作试管号0.5%淀粉溶液pH5.0缓冲液pH6.8缓冲液pH8.0缓冲液稀释唾液12 ml3 ml001 ml22 ml03 ml01 ml32 ml003 ml1 ml2将3支试管放入37水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查第二管，待碘液不变色时，向各管加碘液几滴，观察并记录各管颜色。(三) 酶的激活剂及抑制剂对酶活性的影响1取小试管3支，按下表操作试管号1%淀粉溶液1%CuSO4溶液30.5%NaCl溶液4蒸馏水稀释唾液12 ml1 ml001 ml22 ml01 ml01 ml32 ml001 ml1 ml2将3支试管放入37水浴中，并在白色比色盘上用碘液检查第二

26、管，待碘液不变色时，向各管加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。注：1 稀释唾液加入时应迅速，其中加入沸水浴的一管，当唾液加入后应立即放入沸水浴。2 酶的最适pH受缓冲液性质的影响。如唾液淀粉酶的最适pH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.46.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。3 CuSO4溶液为唾液淀粉酶的抑制剂。4 NaCl溶液为唾液淀粉酶的激活剂。激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化钠到1/3饱和度时就抑制唾液淀粉酶的活性。实验五 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比

27、色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在5

28、40 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉；精密pH试纸。2 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 ml11（2）大离心管：50 ml2（3）烧杯：100 ml1（4）三角瓶：100 ml1（5）容量瓶：100 ml3（6）刻度吸管：1 ml1；2 ml2；10 ml1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3 试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖10

29、0 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100 ml，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3 g DNS和262 ml 2M NaOH溶液，加到500 ml含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 ml蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 ml 70%乙醇中。（5）6 M HCl和6 M NaOH各100 ml。四、操作步骤1 制作葡萄糖

30、标准曲线取7支20 ml具塞刻度试管编号，按表4.1分别加入浓度为1 mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表4.1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/ml葡萄糖标准液（ml）蒸馏水（ml）DNS（ml）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540 nm）0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20 ml，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比

31、色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 ml烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 ml蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20 min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50 ml离心管中，于4 000 r/min下离心5 min，沉淀可用20 ml蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00 g

32、食用面粉，放入100 ml三角瓶中，加15 ml蒸馏水及10 ml 6M HCl，置沸水浴中加热水解30 min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6 mol/L NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100 ml容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10 ml，移入另一100 ml容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。（3）显色和比色取4支20 ml具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表4.2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（ml）总糖待

33、测液（ml）蒸馏水（ml）DNS（ml）光密度值（OD540 nm）查曲线葡萄糖量（mg）70.51.51.580.51.51.59111.510111.5五、结果与计算计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。还原糖含量=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100%样品毫克数 总糖含量=查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数0.9100%样品毫克数六、附注1 离心时对称位置的离心管必须配平。2 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。3 面粉中还原糖含量

34、较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2如何正确绘制和使用标准曲线?实验六 糖的颜色反应和定性鉴定一、目的(1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、糖的颜色反应. Molish反应-萘酚反应1 实验原理糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反

35、应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。2 试剂Molish试剂：取5 g -萘酚用95%乙醇溶解至100 ml，临用前配制，棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。3 操作方法取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1 ml，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1 ml浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。. 蒽酮反应1 实验原理糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9,10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。2 试剂蒽酮试剂：取0.2 g 蒽酮溶于1

36、00 ml 浓硫酸中，当日配制。待测糖溶液，同Molish试验。3 操作方法取试管，编号，均加入1 ml蒽酮溶液，再向各管滴加2 3滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。. 酮糖的Seliwanoff反应1 实验原理该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛，它与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。2 试剂Seliwanoff试剂：0.5 g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2OHCl=21）(V/V) 中，临用前配制。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%果糖溶液。3 操作方法取试管，编号，各加入Se

37、liwanoff试剂1 ml，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。. Fehling (菲林) 试验1 实验原理菲林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。菲林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。2 试剂试剂甲：称取34.5 g硫酸铜溶于500

38、 ml蒸馏水中。试剂乙：称取125 g NaOH、137 g酒石酸钾钠溶于500 ml蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。3 操作方法取试管，编号，各加入Fehling试剂甲和乙1 ml。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2 3 min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。. Benedict试验1 实验原理Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。2 试剂Benedict试剂：将170 g 柠檬酸钠和1

39、00 g 无水碳酸钠溶于800 ml水中；另将17 g硫酸铜溶于100 ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000 ml。 该试剂可长期使用。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。3 操作方法取试管，编号，分别加入2 ml Benedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。. Barfoed (巴弗) 试验1 实验原理在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性，单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所

40、以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。2 试剂Barfoed试剂：16.7 g 乙酸铜溶于近200 ml水中，加1.5 ml冰醋酸，定容至250 ml即可。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。3 操作方法取试管，编号，分别加入2 ml Barfoed试剂和2 3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜色变化。三、注意事项(1) Molish反应非常灵敏，0.001葡萄糖和0.0001蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释

41、后再做。(2) 果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间较长，且只能产生黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色至蓝色产物。(3) 酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。(4) 糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应速度慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来判断。(5) Barfoed 反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现。四、思考题1列表总结和比较本实验六种颜色反应的原理和应用。2运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。-