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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date液质联用技术在药物分析中的应用研究进展滨州医学院毕业设计论文范本及装订顺序目 录摘要1前言21 LC-MS分析原理22 LC-MS仪的组成及其分析条件的选择32.1 LC-MS联用仪的组成32.2 LC-MS分析条件的选择和优化32.2.1接口的选择32.2.2正、负离子模式的选择32.2.3流动相的选择32.2.4流量和色谱柱的选择32.2.5辅助气体流量和温度的选
2、择43 LC-MS在药物分析中的应用43.1 LC-MS在药物筛选方面的应用43.2 LC-MS在药物成分鉴定研究43.2.1中药成分分析53.2.2 抗生素药物成分分析53.2.3中成药、保健品、食品中非法添加化学药物成分的鉴定分析53.3 LC-MS在药物代谢分析的应用63.4 LC-MS在残留药物分析的应用74 展望7参考文献9-液质联用技术在药物分析中的应用研究进展摘要：液相色谱-质谱联用技术以其高分离能力，高灵敏度和专属性强的优势，在药物成分的鉴定分析、药物代谢研究、中成药和保健品中非法添加化学药物成分的鉴定分析以及药物残留分析等方面得到广泛的应用。本文简要综述了近年来液质联用技术在
3、药物分析中的应用，阐述了LC-MS技术在药物筛选，药物成分鉴定研究，药物代谢分析以及残留药物分析方面的研究进展，并对其发展趋势进行了展望。关键词：液质联用；药物分析；应用；进展Recent Development in the Application of LC-MS in Pharmaceutical AnalysisChuanyang SuAbstract: Liquid chromatography-mass spectrometry is regarded as an important technology for many advantages such as high separ
4、ating efficiency, good sensitivity and strong specifity. So it is widely used in analysis of drugs and metabolites, chemical medicine mixed illegally in Chinese medicine and drug residue. This paper briefly reviewed its application in pharmaceutical analysis, the application and development as drug
5、screening, analysis of drugs and metabolites, drug residues were mainly introduced. Finally, the development trend of LC-MS is proposed.Key words: LC-MS；pharmaceutical analysis ; application; development前言液相-质谱联用技术(LC-MS)是20世纪90年代发展起来的一门综合分析技术, LC的高分离效能与MS的高灵敏度,高选择性使之成为当代最重要的分离和鉴定分析方法之一。该技术自20 世纪70
6、年代进行开创研究以来，经历了长期的实践和研究过程，直到90 年代大气压电离技术成熟后，各种商品化仪器相继问世，LC-MS技术才得以迅速发展，成为科研和日常分析的有力工具。液相-质谱联用技术与气相色谱-质谱联用技术( GC-MS)相比,气相色谱-质谱联用技术发展较早,技术较为成熟,但GC样品要求有一定的蒸汽压,实际应用中,只有少部分样品可以不经过预先处理可达到GC的分离要求,多数情况下需要做预处理或衍生化使之成为易汽化的样品才能进行GC-MS分析;而液相色谱不受上述限制,可分离高极性的和热不稳定的化合物,这使得液相-质谱联用技术具有更广阔的应用前景1。1 LC-MS分析原理LC-MS仪主要由高效
7、液相色谱，接口装置(LC与MS之间的连接装置，同时也是电离源)，质谱仪组成。混合样品通过液相色谱系统进样，由色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入质谱仪的离子源处并被离子化，然后离子被聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号被转变为电信号，传递至计算机数据处理系统，根据质谱峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析。LC-MS是通过一个“接口”来实现的，所用接口合适与否，不仅会影响质谱仪的灵敏度，而且影响质谱仪所能提供的结构信息和应用范围。在接口研制方面，前后发展了有20多种2，其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透膜界面、热喷雾界面和离子束界面，但这些技术都有不同
8、方面的限制和缺陷，直到大气压电离技术(API)成熟后，液-质才得以飞速发展。大气压电离技术包括电喷雾电离和大气压化学电离(APCI)。作为LC-MS联用仪的质量分析器，最常用的是四极杆分析器，离子阱分析器和飞行时间分析器。四极杆分析器由4根棒状电极组成3，当样品量很少，而且样品中特征离子已知时，可以采用离子监测，这种扫描方式灵敏度高，通过选择适当的离子使干扰组分不被采集，可以消除组分间的干扰。飞行时间质量分析器的特点是质量范围宽，扫描速度快，既不需电场也不需磁场。但是，长时间以来一直存在分辨率低这一缺点，主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。目前，通过采取激光脉冲电离方式
9、，离子延迟引出技术和离子反射技术，可以在很大程度上克服上述3个原因造成的分辨率下降，这种分析器已广泛应用于液相色谱-质谱联用仪中。离子阱质量分析器的特点是结构小巧，质量轻，灵敏度高，而且还有多级质谱功能，其与四极杆分析器类似，离子在离子阱内的运动遵守所谓马蒂厄微分方程，也有类似四极杆分析器的稳定图。在稳定区内的离子，轨道振幅保持一定大小，可以长时间留在阱内，不稳定区的离子振幅很快增长，撞击到电极而消失。2 LC-MS仪的组成及其分析条件的选择2.1 LC-MS联用仪的组成HPLC部分：高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、记录仪。MS部分：供电系统、进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器
10、。接口装置：（也是电离源）。2.2 LC-MS分析条件的选择和优化2.2.1接口的选择ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子(如蛋白质)APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。2.2.2正、负离子模式的选择选择的一般原则为:正离子模式适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯，含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。2.2.3流动相的选择常用的流
11、动相为甲醇，乙腈，水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵，乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸，乙酸和氨水等调节pH值。LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。2.2.4流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速4是150ul/min，应用4。6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lml/min，建议200400ul/minAPCI的最佳流速lml/min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用 100 mm的
12、短柱(此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离)。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。2.2.5辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可5。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。3 LC-MS在药物分析中的应用3.1 LC-MS在药物筛选方面的应用在药物筛
13、选工作中，是否能有效去除已知的化合物，以及能否对潜在的新药前体进行早期鉴定是高通量筛选的关键。因此，必须在分离化合物的初期，运用各HPLC检测手段来指导分离具有特定结构的化合物。目前MS是分子检测中最灵敏的方法，并能得到被测物的分子量及化学结构信息。Bringmann6等采用HPLC-核磁共振(nuclear magnetic resenace，NMR)和LC-MS等几种分析手段相结合的方法考察了热带葛藤类植物提取物中所含有的成分，利用HPLC-NMR和LC-MS分析发现了2个新的天然产物，并鉴定了结构，确定了绝对构型。Wolfender7等运用此法对龙胆科、豆科的多种植物进行了检测，实验表明
14、，仅用少量的样品就能快速而准确地对具有生物活性的化合物进行分离与鉴别。萝摩科三酚丹是一种具有抗肿瘤活性的药用植物，其主要有效成分为菲吲哚里西丁类生物碱。首先采用分离得到3种骨架10个菲吲哚里西丁类生物碱，在此基础上用LC-MS技术对有效部位进行了考察，分析检测到11个微量的菲吲哚里西丁类生物碱成分。通过参照单体化合物的质谱裂解规律，分析推测了一些微量成分的化学结构。3.2 LC-MS在药物成分鉴定研究 液质联用技术将液相色谱高效的在线分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力相结合,可以同时得到化合物的保留时间、分子量及特征结构碎片等丰富的信息,是组分复杂样品和微重样品分离分析最有力的研究手
15、段。3.2.1中药成分分析中药药物成分复杂多样,分离提纯难度大,液质联用技术对样品不需要进行繁琐和复杂的前处理,因此在中药成分分析研究得到广泛应用,包括对已知成分的定性定量分析,在对未知成分的研究中,质谱检测器可以给出大量的结构信息,结合同类已知结构化合物的裂解规律,或结合其他检测方法,即可对未知成分进行直接分析。袁杰8等采用 HPLC /ESI-MS 联用的方法对朝鲜淫羊藿的化学成分进行分析,以ESI-MS 获得的准分子离子峰确定化合物的分子量,根据多级质谱所得的碎片峰,结合紫外光谱、HPLC 的保留时间等信息鉴定了 9 个黄酮苷类化合物。KiteG C9等采用 HPLC /ESI-MS 分
16、析了皂树中一百多种皂苷类成分的结构。总之,液质联用技术不仅能够对中药化学成分进行定性和定量研究,还能够通过串联质谱给出的结构信息推测某些未知成分,指导下一步的研究工作。3.2.2 抗生素药物成分分析许多抗生素品种由于其产生菌绝大多数都是产生结构相似的多组分复合物,用常规分析方法对其进行快速鉴别和相关物质分析比较困难,药品质量难以控制。液质联用技术以其强有力的分离和分析能力,在这类抗生素药物成分分析和相关物质的鉴定上显示了巨大的优势。牛长群10等用 LC -ESI - MS 分析了氨苄西林、阿莫西林中的相关物质，确定了其结构,为氨苄西林、阿莫西林的相关物质的质量控制提供了重要证据。胡敏等11应用
17、 HPLC-(+) ESI-MS 快速鉴定了头孢硫脒的降解产物。总之,高效液相质谱联用技术集液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度高选择性于一体,使同时分析多个化合物成为可能,并显示了极大优势。3.2.3中成药、保健品、食品中非法添加化学药物成分的鉴定分析近几年来，中成药或保健品非法添加化学药物屡见不鲜,患者在不知情的情况大量服用,可能造成严重的不良反应。液相-质谱联用技术,灵敏度高的优点,越来越多地应用于中成药或保健品非法添加药物成分的鉴别,成为打假治劣的一把利剑。张启明12等用LC2ESI(+)/MS对补肾壮阳类中药及中药保健品中非法掺入的化学药物成分枸橼酸西地那非进行定性鉴定分析,在所测的
18、65批样品中,13种被检测出含有枸橼酸西地那非。丘颖姮13等建立了LC-ESI(+)/MS对减肥类药品和保健品中非法掺入的酚酞的专属性方法,结果在114种受试减肥类药品及保健品中, 42种被检测到掺入酚酞。3.3 LC-MS在药物代谢分析的应用药物代谢是研究药物进入人体后，在体液、酶等的作用下进行的生化反应过程14。对药物代谢的研究，包括药物及其代谢物的分离、鉴定、体内体外代谢的比较、代谢途径的追踪、痕量分析测定。利用液质联用技术，可以很好地分离纯化鉴定代谢物样品，并且能对以往难于辨识的痕量药物代谢物进行鉴定及定量分析。液质联用技术在分析各种复杂生物基质中的药物代谢产物时,由于其选择性强,灵敏
19、度高,不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作,而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量药物代谢产物,尤其是串联质谱(MS/MS)的应用,通过多反应监测(MRM) ,可以大大提高分析的专一性和灵敏度。同时利用碰撞诱导解离可将化合物的分子离子或准分子离子打碎,通过中性丢失扫描、母离子扫描和子离子扫描,并与原型药物结构信息相比较,即可鉴定出代谢产物的结构。国内外曾多有采用LC-MS法进行药物代谢研究的报道，不仅可以避免复杂的分离纯化代谢物样品，而且能分离鉴定难于辨识的痕量代谢产物。表1列举了2004年以来国内外的部分应用。表1串联质谱在药物代谢研究中的部分应用药物及代谢物药代动力学研究内容分析方法法罗
20、培南15匹多莫德16罗通定17罗红霉素18黄芩素19蒿甲醚20佐米曲普坦21盐酸哌唑嗪22氯雷他定23在健康人体内的药动学及饮食对药动学的影响建立LC /MS/MS测定人血浆中匹多莫德的浓度研究罗通定在大鼠胆汁中的主要代谢产物建立人血浆中罗红霉素的HPLC2MS方法,测定其片剂的药物动力学参数及相对生物利用度。发现了黄芩素在小鼠体内两个代谢产物建立快速、灵敏液相色谱2串连质谱法测定血浆中蒿甲醚及其活性代谢产物双氢青蒿素浓度建立测定人血浆佐米曲普坦血药浓度的液质联用方法,研究佐米曲普坦在中国健康志愿者体内药动学。研究盐酸哌唑嗪的人体药动学及生物等效性用于人血浆中氯雷他定浓度的测定LC-API/M
21、SLC-ESI(+)/MSLC-ESI(+)/MSLC-ESI(+)/MSLC-ESI(-)/MSLC-ESI/MSLC-ESI(+)/MSLC-ESI(+)/MSLC-ESI(+)/MS3.4 LC-MS在残留药物分析的应用在液质联用技术出现以前,残留药品由于其含量很低,缺乏适用仪器,检测方法落后,因此没有引起人们的重视。随着科学技术的发展成熟,液相色谱-质谱联用技术由于其高灵敏度的优势,广泛用于残留药物分析中。吉永亮24等采用高效液相色谱-电喷雾-串联四极杆质谱法,以甲醇-乙腈-0.1%甲酸(202060)为流动相建立了测定蜂蜜中残留氯霉素的方法,加入同位素内标氯霉素-d5,经Oasis
22、SPE柱净化,采用多反应检测(MRM)方式测定321 /152(氯霉素)和326 /157 (氯霉素-d5 ) ,方法检出限为0.02gkg- 1 ,定量限为0.1 gkg- 1。谢文25等建立了动物源食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量的LC-ESI/MS方法。以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,采用负离子方式扫描,多反应监测氯霉素四对离子(321.0/151.9, 3211/256.6, 321.0/194.2, 321.0/175.4) ,甲砜霉素两对离子( 354.1/185.0, 354.1/290.0) ,氟苯尼考两对离子( 356.0/335.9, 356.0/185.1 ) 和同
23、位素内标氯霉素-d5( 326.0/157.1 ) 。该方法的测定低限是0.1gkg- 1。4 展望LC-MS技术是一种普适性的分析技术，近年来获得了迅速的发展，在药物分析检验方面具有十分广阔的应用前景26。该技术路线的起点较高，故与目前的各种免疫法和高效液相色谱法相比，具有专一可靠、灵敏度高、操作简便、试剂成本低廉、可应对高通量的样品分析测试等特点，可对众多生物基质内的微量物质进行可靠的定量检测与定性验证，远远满足国内外对食品安全控制与监管的要求，与已成熟的GC-MS联用技术相比，LC-MS还处于发展阶段，但LC-MS所具备的一系列优点，决定了它的应用前景比GC-MS更为广泛。LC-MS的发
24、展可以说是接口技术的发展，扩大LC-MS应用范围以使热不稳定和强极性化合物在不加衍生化的情况下得以直接分析并将质谱分析用于生物大分子是液质接口技术的发展方向27。LC-MS各种“软”离子化接口技术，特别是大气压电离(API)技术的开发正是迎合了这个方向，简化了样品处理过程，被人们称为LC-MS技术乃至质谱技术的革命性突破。HPLC/API/MS作为高灵敏度的简捷方法被广泛应用于食品分析的各个领域，API接口的研制成功，解决了HPLC流速与MS仪在真空条件下工作的匹配问题，扩大了HPLC /MS联用技术的应用范围，极大地促进了食品安全分析学科的发展。在串联质谱方面，目前以四极杆串联质谱为主，它可
25、进行MS1和MS2操作(空间上)。离子阱质谱和傅利叶变换质谱(FT-ICR-MS)亦可完成多级串联质谱分析(时间上)，离子阱质谱通过改变阱里射频场最多可进行10级MS操作，FT-ICR-MS通过离子回旋共振进行多级MS操作。飞行时间质谱(TOF)作为第2个质量分析器，由于其分辨率高、质量范围宽、扫描快和灵敏度高等优点，成为一个重要的发展方向。LC-MS/MS联用技术愈来愈多地受到人们的重视，一些国际著名的分析仪器公司和研究机构建立多个实验室参于研究开发。总之，为应用目的而建立的LC-MS/MS联用技术会越来越多，应用研究课题也会越来越多。综上所述，LC-MS联用技术在药学研究中的应用日趋广泛，
26、LC-MS技术将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点能力相结合，组成了较完美的现代分析技术。近年来，LC-MS技术在应用方面取得了很大进展，国家标准委、美国FDA 及欧盟等权威机构也该技术引入药品食品质量监控中，LC-MS技术由原先只是少数专家进行研究的手段发展成为一种常规应用技术。随着现代化高新技术的不断发展，LC-MS技术将不断完善，必将在药物分析领域中发挥越来越重要的作用。参考文献：1Liu X D, Liang Q L, Luo G A, et al1The app lication of Liquid Chromatography-mass Spectrometry in the fi
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