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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date生物化学教案-上册绪论生物化学教案院系： 食品与生物工程学院专业： 生物工程09级 教师： 冯 昕 时间： 2010-2011年第一学期 所用教材：王镜岩、朱圣庚主编高等教育出版社出版绪论主要内容：生物化学的涵义、学科的形成和发展、本课程的内容组成、为什么要学习生化、学习生化注意的几个问题目的：了解生物化学的含义及生物化学的发展史，掌握生物化学组成的30种分子。一、生
2、物化学的含义生物化学是关于生命的化学本质的科学。它是以研究生物体的化学组成，生物物质的结构和功能，生命过程中物质变化和能量变化的规律，以及一切生命现象的生物化学原理为基本内容的科学。二、学科的形成和发展1、史前（19世纪以前）积累了许多与生化有关的实践经验。我们的祖先早在公元前22世纪就用谷物酿酒；公元前12世纪就会制酱；公元7世纪孙思邈就用车前子、杏仁等中草药治疗脚气，用猪肝治疗夜盲症；18世纪70年代，Scheele从动植物材料中分离出甘油及柠檬酸、苹果酸、乳酸、尿酸等有机物；18世纪80年代，Lavoisier证明了呼吸就是氧化作用，他还证明了酒精发酵本质上是一系列的化学过程。2、19世
3、纪，人们对生命现象展开了比较广泛的研究，对生命的化学本质的认识有了很大的提高，为生物化学学科的形成奠定了基础。1810年Gay-lussac推导出了酒精发酵的反应式；19世纪50年代Pasteur证明了酒精发酵是微生物引起的，排除了发酵自生论。1877年，Hoppe-Seyler首次提出“biochemie”(生物化学)这一名词，并创办了生理化学杂志；1897年Bchner兄弟利用酵母汁液发酵蔗糖产生酒精的研究，是生化发展早期的一个里程碑。3、上世纪30年代到80年代，生物化学进入快速发展的时期。脂肪酸氧化降解途径、糖酵解途径、三羧酸循环途径的基本化学过程都是在30年代提出的；1955年，Sa
4、nger首次完成了牛胰岛素分子的一级结构分析；1965年，我国生物化学家率先完成了结晶牛胰岛素分子的人工合成；1965年，Monod提出了蛋白质变构学说。4、近20多年来，酶工程、遗传工程、细胞工程都得到了快速发展。其中DNA重组技术已成为当代最突出的科学成就之一。三、本课程的内容组成1、生物体的化学组成： 30种前提物质称为生物化学的字母表20种氨基酸；5种芳香族碱基，2种嘌呤（腺嘌呤和鸟嘌呤）和3种嘧啶（胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶）；2种草糖，D-葡萄糖和D-核糖；脂肪酸、甘油和胆碱。由以上单位分子或它们的衍生物为基本单位组成的糖类、脂类、蛋白质、核酸以及对代谢起催化作用的酶、维生素和激素，
5、通常被生物化学中的四大基本物质和三大活性物质。2、代谢的研究代谢是生物体与外界的物质和能量交换过程，是活细胞进行的复杂的系列酶促反应过程，包括同化作用和异化作用。六类化学反应：氧化还原反应、基团转移反应、水解反应、裂解反应、异构反应和合成反应。3、遗传的分子基础及代谢调节生物性状之所以能代代相传，是靠核酸和蛋白质作为物质基础。DNA是遗传信息的载体，通过DNA分子的半保留复制，将遗传信息传递给子代，再通过蛋白质的生物合成将生物的遗传性状表达出来。4、生化实验生化是一门实验学科，生化理论本身就是通过实验研究发展起来的。新技术的应用往往成为生化理论发展的关键。1940年，瑞典的Svedberg发明
6、了超速离心技术；1937年Tiselins发明了电泳技术；上世纪40年代英国化学家发明了纸上层析，Sanger对胰岛素的序列分析主要是依靠纸上层析技术完成的；（1）分配色谱法的创立快捷、经济的分析技术由Martin.Synge创立。（2）Tisellius用电泳方法分离血清中化学构造相似的蛋白质成分。吸附层析法分离蛋白质及其他物质。（3）Svedberg第一台超离心机，测定了高度复杂的蛋白质。（4）荧光分析法，同位素示踪，电子显微镜的应用，生物化学的分离、纯化、鉴定的方法向微量、快速、精确、简便、自动化的方向发展。生化实验是生化课程内容的重要组成部分。四、为什么要学习生化生物化学既是由多学科共
7、同孕育形成并发展起来的边缘学科，又是生物及医、农各学科必不可少的基础学科；既是在理论和技术方面都有很大影响的带头学科，又是涉及面很广的应用学科。无论就其在自然科学中的地位来看，还是从其在国民经济建设中的作用来看，都是一门十分重要的学科。使同学们了解生物化学发展的历史，掌握生命活动中重要组成成分糖、脂、蛋白质、酶、核酸的结构和性质，了解维生素、抗生素、激素和生物膜组成、种类、性质和功能，对于生物体内分子水平上所发生各种代谢反应有较深入的认识，熟悉其中重要的生物化学反应过程，同时对生物体内的各种反应的规律有一个基本的认识，从而为学习其他的高等生物学课程打下良好的基础。五、学习生化应注意的几个问题1
8、、建立起以生物功能为轴线的思维体系生物化学的理论体系是以生物功能为轴线建立起来的，不同于无机化学以元素周期为基础的理论体系；也不同于有机化学以官能基团为基础的理论体系。从静态化学到动态化学都贯穿着生物功能这根轴线。而且，分子结构和生物功能的关系更是生化讨论的内容。2、注意学习技巧3、要充分利用实验课的机会来提高分析问题、解决问题和动手的能力。第一章 蛋白质重点：氨基酸的分类、氨基酸的酸碱化学、氨基酸的化学反应、氨基酸混合物的分析分离；肽、肽单位和肽平面、蛋白质一级结构的测定、稳定蛋白质三维结构的作用力、二级结构：多肽链折叠的规则方式、超二级结构和结构域、球状蛋白质与三级结构、亚基缔合和四级结构
9、；蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀、蛋白质的分离纯化方法。难点：肽、肽单位和肽平面、多肽链折叠的规则方式、超二级结构和结构域、蛋白质一级结构的测定、蛋白质的分离纯化方法。蛋白质是一类重要的生物大分子，蛋白质在生物体内占有特殊的地位，蛋白质和核酸是构成细胞内原生质的主要成分，而原生质是生命现象的物质基础。蛋白质存在于几乎所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。一、蛋白质的化学组成 蛋白质主要由C、H、O、N、S等元素组成，有些蛋白质还含有其它的一些元素，如铁、铜、锌等。蛋白质的平均含氮量为16，这是蛋白质元素组成的一大特
10、定，也是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。测得含氮量之后，只要乘以6.25就可得到物质的蛋白含量。二、蛋白质的水解蛋白质的水解是研究蛋白质组成的重要方法。蛋白质可以被酸、碱或酶催化水解，得到各种氨基酸或小的肽段。根据蛋白质的水解程度可以分为完全水解和部分水解两种情况。完全水解也称彻底水解，得到的是各种氨基酸的混合物。部分水解也称不完全水解，得到的是各种大小不等的肽段和氨基酸。水解的方法主要由酸水解、碱水解和酶水解三种。1、酸水解常用H2SO4或HCl。一般用6mol/LHCl，4mol/LH2SO4，回流煮沸20h左右可使蛋白质完全水解。优点是不引起消旋作用，可到L-氨基酸。缺点是色氨酸安全被破
11、坏，羟基氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）部分分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。2、碱水解一般用5mol/NaOH，煮沸1020h，可使蛋白质完全水解。但多数氨基酸不同程度的被破坏，并产生消旋现象，得到D-和L-型氨基酸，能引起精氨酸脱氨形成鸟氨酸和尿素。但色氨酸是稳定的。3、酶水解不产生消旋作用，不破坏氨基酸，但使用一种酶往往不能水解彻底。需要几种酶的协同作用。三、氨基酸（一）-氨基酸的一般结构从不同天然蛋白质完全水解产物中分离到的20种基本氨基酸，称为常见氨基酸。它们的分子结构有两个共同的特点：1、除脯氨酸是亚氨基酸外，其余19中氨基酸都是-氨基酸，即与羧基相邻的碳原子（-碳原子，C）上都
12、有一个氨基，连接在-碳原子上的还有一个氢原子和一个可变的侧链（R），各种氨基酸的区别作于R的不同。通式如图；2、 除了甘氨酸之外，都是L-型氨基酸。甘氨酸的-碳原子不是不对称碳原子，其它都是。不对称碳原子是指与四个不同的原子或原子基团共价相连因而失去对称性的碳原子。也称手性碳原子、手性中心。常用C*表示。构型是指不对称碳原子的四个取代基在空间的相对取向。两种构型形成镜面异构，也叫旋光异构。甘油醛C2为不对称碳原子，其上的羟基有两种安排，羟基向左为L型，向右为D型。DL与（）不同。记三字母简写式。（二）氨基酸的分类氨基酸分类的方式很多，可以从不同的角度去分。1、根据R基团的不同可分为4类。（1）
13、脂肪族氨基酸 包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、Lys、Arg共15种。（2）芳香族氨基酸 包括Pre、Tyr。（3）杂环氨基酸 包括His、Trp。（4）杂环亚氨基酸 Pro。2、根据R基团的极性不同可分为2类。（1）非极性氨基酸 共9种。Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pre、Trp、Met、Pro。（2）极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸 包括Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys，此组氨基酸比非极性氨基酸易溶于水，他们带有不解离的基团可与水形成氢键。带负电荷的极性氨基酸 包括Asp、Glu，他们属于酸
14、性氨基酸，在pH7时带负电荷。带正电荷的极性氨基酸包括Arg、Lys、His，他们属于碱性氨基酸，在pH7时带正电荷。（3）按酸碱性来分酸性氨基酸 Asp、Glu。碱性氨基酸 Arg、Lys、His。中性氨基酸 其它氨基酸。（4）人体是否能合成分必需氨基酸 人体不能合成，必需从食物中摄取的氨基酸。包括Lys、Thr、Met、Val、Leu、Ile、Trp、Pre。半必需氨基酸 成人能合成但新生儿不能合成的氨基酸。包括His、Arg。非必需氨基酸其它氨基酸。（三）氨基酸的理化性质1、两性解离和等电点（1）概念氨基酸分子中具有碱性基团氨基（-NH2）和酸性基团羧基（-COOH），在晶体或水溶液中主
15、要以兼性离子的形成存在。它即有酸的作用，又有碱的作用。象氨基酸这种在同一分子中带有性质相反的酸、碱两种解离基团的化合物，称为两性化合物或两性电解质；两性电解质的解离受环境pH值的影响，改变环境的pH可以使氨基酸带上不同的电荷，也可使它处于正负电荷相等的状态，此时氨基酸的净电荷为零，此时的pH称为氨基酸的等电点。在等电点时氨基酸的净电荷为零，在电场中既不向正极移动也不向负极移动。而且此时氨基酸的溶解度最小，易发生沉淀。各种氨基酸都有其特定的等电点，发酵生产中，可根据这种性质，从发酵液中提取并纯化各种氨基酸。（2）等电点的计算侧链不解离的氨基酸pI=0.5(pKa1+pKa2) 酸性氨基酸pI=0
16、.5(pKa1+pKa2)碱性氨基酸pI=0.5(pKa2+pKa3)2、氨基酸的化学反应（1）-氨基参加的反应与亚硝酸反应 脱氨形成N2，N2中的N一半来自氨基，此法可用于氨基酸的定量测定。与酰化试剂反应氨基被酰基化，如与苄氧甲酰氯等反应。此类试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂。烃基化反应 氨基的一个氢可被烃基取代，如2,4-二硝基氟苯（DNFB,FDNB）在弱碱性溶液中形成二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），此反应被Sanger用于鉴定蛋白质的N末端氨基酸。再如与苯异硫氰酸酯（PITC）在弱碱性条件下形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，此衍生物在硝基甲烷中与酸反应生成苯乙内酰硫
17、脲（RTH）衍生物。这个反应被Edman用于鉴定蛋白质N端氨基酸。在多肽和蛋白质序列测定放面占重要地位。形成西佛碱反应与醛反应生成西佛碱。脱氨基反应氨基酸在体内经氨基酸氧化酶等催化脱去-氨基，形成酮酸（见下册）。（2）-羧基参加的反应成盐和成脂反应与碱成盐与醇成脂，具有保护羧基作用，同时使氨基活化，易与酰基或羟基反应，这就是为什么氨基酸的酰基化和羟基化需要在碱性溶液中进行的原因。成酰氯反应与二氯亚砜或五氯化磷反应生成酰氯。可使氨基酸的羧基活化，在多肽人工合成中常用。脱羧基反应经氨基酸脱羧酶作用放出二氧化碳并生成一级氨。叠氮反应氨基酸的氨基通过酰基化加以保护，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝
18、酸反应即变为叠氮化合物。此反应使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。（3）-氨基和-羧基共同参与的反应与茚三酮反应茚三酮在弱酸性溶液中与-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质。颜色的深浅与氨基酸的浓度成正比，利用此反应可以定性或定量氨基酸。利用茚三酮显色可以定性鉴定并用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3,而直接生成亮黄色化合物，最大光吸收在440nm。成肽反应一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的键称肽键。羰氨反应氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，
19、进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素”。食品加工中将这种反应称为褐变。原料褐变后不仅影响原料的利用率，还有很多毒副作用。（4）侧链R基参加的反应很多基团参与反应，其中一些是蛋白质化学修饰的基础，所谓蛋白质的化学修饰就是在较温和的条件下，以可控的方式使蛋白质与某种试剂（称化学修饰剂）起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。化学修饰在蛋白质的结构与功能的研究中是很有用的。酪氨酸的酚基在3和5位易发生亲电取代反应，还可以与重氮化合物结合生成橘黄色的化合物。组氨酸的咪唑（zuo）基与重氮苯磺酸反应形成棕红色化合物。精氨酸的胍基在硼酸钠缓冲液中与1,2-环己二酮反应生成
20、缩合物，此缩合物在羟胺缓冲液中可重新生成精氨酸。色氨酸的侧链吲哚基在温和的条件下可被N-溴代琥珀酰亚胺氧化，此反应可用于分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量。蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，可与烃化试剂如甲基碘反应形成锍盐。半胱氨酸的巯基反应性能很高，在微碱性环境中-SH可解离为硫醇阴离子，能与卤化烷如碘乙酸、甲基碘等反应生成稳定的烷基衍生物。半胱氨酸的巯基能打开乙撑亚胺（氮丙啶）的环，生成的侧链带有-NH3，它为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新的位点。巯基还能和各种金属离子形成络合物。由于许多蛋白质（酶）的活性中心有-SH，当遇到重金属离子而生成硫醇盐时将导致酶的失活。半胱氨酸可与二硫硝
21、基苯甲酸（DTNB）或称Ellman试剂发生硫醇-二硫化物交换反应，1分子半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲酸的释放，它在pH8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可以利用分光光度计定量测定-SH的含量。巯基易被氧化形成-S-S-，二硫键在稳定蛋白质的构象上起重要作用。（四）氨基酸的光谱性质组成蛋白质的氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在红外区和远紫外区（中性氨基酸酸性氨基酸。通过改变洗脱液的pH，可以改变氨基酸的带电情况，从而使氨基酸从离子交换树脂上洗脱下来。除上述方法之外还有气相色谱和液相色谱，较先进。四、蛋白质的一级结构（一）一级结构的含义一级结构又叫初级结构指的是肽链中的氨基酸的组成
22、和排列顺序。一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物学功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。（二）多肽链肽键一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基所成的酰胺键，在蛋白质化学中称为肽键，肽键是一个酰胺键，由于酰胺键氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振相互作用，表现出高稳定性。组成肽键的C-N键，具有40双键的性质，不能自由旋转。肽键中的四个原子和它们相邻的2个-碳原子都处于同一平面上，此刚性结构的平面称为肽平面或肽酰平面，其中H和O处于C-N键的两侧形成反式。很多氨基酸依次通过肽键连接而形成的链状结构称为多肽链。由2个氨基酸组成的肽称为二肽，三肽以上
23、根据含氨基酸的多寡称为寡肽、多肽。蛋白质就是由几十个到几百个甚至上千个氨基酸组成的多肽。肽链的骨干是由-NH-HCR-CO-单位规则的重复排列而成，称之为共价主链。在多肽链中两个氨基酸失去一分子水形成肽键，故已经不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基。多肽链通常含有一个游离的末端氨基和一个游离的末端羧基，称为氨基末端（N末端）和羧基末端（C末端）。书写多肽链时，一般是将N末端写在左边，C末端写在右边。多肽的命名是根据参与其组成的氨基酸残基来确定，规定从肽链的N末端残基开始，称为某氨基酰某氨基酰某氨基酸。多肽链的共价结构除了肽键外，还有二硫键，即肽链上的两个半胱氨酸残基的巯基脱氢形成，又称“硫桥
24、”，二硫键对蛋白质的空间结构非常重要。（三）一级结构分析1、一般程序 多肽链的氨基酸测序主要是根据英国F.Sanger实验室中发展起来的方法进行测定的，这个方法首先应用于胰岛素的氨基酸序列的测定，Sanger因此获得1958年诺贝尔奖。现在常用的氨基酸序列分析仪是根据Edman反应原理发展起来的。只简要的介绍蛋白质序列测定的一般步骤。（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据N末端和C末端的数量。（2）拆分蛋白质分子的多肽链（3）断开多肽链内的二硫键，一般用甲酸氧化或巯基化合物还原。（4）分析每一多肽链的氨基酸组成，一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，并计算氨基酸成分的分子比。（5）鉴定多肽链的
25、N-末端和C-末端残基，建立两个氨基酸序列的参考点。（6）断裂多肽链为较小的片段（7）测定各肽段的氨基酸序列，目前常用Edman降解法。（8）根据上述个肽段的氨基酸序列测定结果，利用两套或几套肽段的序列彼此间的交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸序列。（9）确定二硫键的位置。2、N末端和C末端氨基酸残基的测定（1）N末端的分析方法二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法多肽或蛋白质的游离末端NH2与DNFB反应后，生成DNP-多肽或蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解的稳定性比肽键高，因此DNP-多肽经水解后，只有N末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别生成的DN
26、P-氨基酸便可知多肽链的N末端残基。丹磺酰氯法丹磺酰氯是二甲氨基苯磺酰氯的简称，所写DNS。原理与DNFB法相同，由于丹磺酰氯具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍。苯异硫氰酸酯（PITC）法 多肽或蛋白质的末端氨基能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰蛋白质或多肽，简称PTC-多肽或蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，N-末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N末端的氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。代表末端氨基酸的是溶液中的PTH-氨基酸，分析PTH-氨基酸即可知末端氨基酸。氨肽酶法 氨肽酶能从多肽链的N末端逐个的
27、向里切，根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道蛋白质的N末端氨基顺序。（2）C末端的分析方法肼解法目前测定C末端的最重要的化学方法。蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外，其它的氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。生成的氨基酸酰肼化物可与苯甲醛作用变为水不溶性的二苯基衍生物沉淀。上清液中的游离C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法及层析技术进行鉴定。肼解过程中谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破环不易测出，C末端的精氨酸转变为鸟氨酸。还原法 肽链的C末端氨基酸可与硼氢化锂反应生成相应的-氨基醇。肽链完全水解
28、后，-氨基醇可用层析法进行鉴定。羧肽酶法最有效的方法，最常用的方法。羧肽酶能从多肽链的C末端逐个的向里切，根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道蛋白质的C末端氨基顺序。3、二硫键的断裂和多肽链的分离有的蛋白质由多条肽链，由两种情况，一种是几条肽链之间借助非共价键连接起来，另一种是几条多肽链通过共价二硫键交连在一起。第一种可用变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，就可将亚基拆开。第二种需打开二硫键，最普通的方法是用过量的-巯基乙醇处理可使-S-S-还原为-SH，与此同时反应系统需要有8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白
29、质变性，多肽链松散，才能使还原剂还原内部的二硫键。4、氨基酸组成的测定 用于蛋白质的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。5、多肽链的部分断裂和肽段的分离目前的蛋白质序列测定方法一次能测定的序列都不长，最常用的Edman化学降解法一次只能连续降解几十个残基。故必须把大的肽段断裂成小的肽段。裂解时要求断裂点少，专一性强，反应产率高。（1）酶裂解法最常见的蛋白水解酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶。这些酶都是肽链内切酶。胰蛋白酶，最常用的蛋白酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键。糜蛋白酶，专一性差常用于断裂较短的多肽链或大肽段。胃蛋白酶，断
30、裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸的肽键。金黄色葡萄球菌蛋白酶，也称Glu蛋白酶，在pH7.8的磷酸缓冲液中，它能断裂谷氨酸残基和天冬氨酸残基羧基形成的肽键。在pH7.8的碳酸氢铵缓冲液或pH4.0的醋酸铵缓冲液中，只能断裂谷氨酸残基羧基侧的肽键。羧状芽孢杆菌蛋白酶，也称Arg蛋白酶专门断裂精氨酸羧基形成的肽键。（2）化学裂解法溴化氰断裂，只断裂甲硫氨酸残基的羧基形成的肽键。羟胺断裂，NH2OH能专一的断裂-Asn-Gly-之间的肽键，但专一性不很强，Asn-Leu及Asn-Ala之间的肽键也能断裂。 断裂后的肽段可用凝胶过滤、电泳，层析等方法分离提纯。6、肽段的氨基酸序列测定多肽链经降解和分离后
31、得到的大小合适、纯度合格的肽段，即可进行氨基酸顺序的测定。主要的测定方法是Edman化学降解法，此外还有酶法、气谱质谱联用法等。7、肽段在多肽链中此序的决定多肽如果指断裂2或3段，则根据N末端氨基酸或C末端氨基酸即可推知其序列，但大多数断裂不止3段，这就需要2种以上的方法断裂样品，形成2套或几套肽段，不同的方法指的是断裂的专一性不同，即切口彼此错位的方法。故2套肽段正好相互跨过切口而重叠，这种跨过切口而重叠的肽段称为重叠肽，借助重叠肽可以确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。如：肽段1：OUS、PS、EOVE、RLA、HOWT 肽段2：SEO、WTOU、VERL、APS
32、、HO全序列：HOWT、OUS、EOVE、RLA、PS8、二硫键位置的确定用胃蛋白酶水解，胃蛋白酶专一性差，切点多，肽段较小易于分离鉴定，而且其最适pH为2.0左右，在此条件下二硫键不易破坏。然后用对角线电泳找出含二硫键的肽段，测定其序列以推断二硫键的位置。（四）一级结构举例第一个被阐明一级结构的蛋白质是牛胰岛素。也是第一个被人工合成的蛋白质。牛胰岛素分子：51个残基分A、B两条链；A链有21个残基，B链有30个残基；A链有一链内二硫键，另有两个链间二硫键。（五）一级结构与功能的关系蛋白质的一级结构决定了它的高级结构，进而也就决定了蛋白质的生理功能。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基
33、酸序列相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等方法。同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性称为序列同源性。不变残基和可变残基。（六）体内活性肽生物体内有很多游离存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属于激素类。如催产素、加压素、舒缓素等都是9肽。有些微生物产生的活性肽是抗生素类物质，如短杆菌肽S、多粘菌素E、放线菌素D等。鬼笔鹅膏产生的a-鹅膏蕈碱是一种环状8肽，能与真核细胞的RNA结合，抑制RNA的合成。动物、植物和微生物中都含有的一种还原型三肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，称为谷胱甘肽（GSH）。
34、在细胞中是某些蛋白质和巯基酶的缓冲剂。五、蛋白质的三维结构（一）构型与构象构型：是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型，分子从一种构型变成另一种构型，必须发生共价键的断裂。构象：构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的一种立体结构。天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。（二）稳定蛋白质三维结构的化学键 稳定蛋白质三维结构的作用力重要是一些所谓弱的相互作用或称非共价键或次级键。包括氢键、范德华力 、疏水相互作用或盐碱（离子键）。1氢键氢键是一
35、种静电吸引，当一个电负性较大的原子x与一个氢原子结合形成基团时，具有很大的偶极矩，成键电子云偏向x，氢原子核的外侧裸露，显正电性。当其遇到另一个电负性较大，半径较小，带有孤对电子的y原子是，便产生静电吸引。这种静电吸引即所谓的氢键。 xHy。氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的作用。2范德华力广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即定向效应、诱导效应和分散效应。定向效应发生在极性分子或极性基团之间，即永久偶极间的静电相互作用。诱导效应发生在极性物质与非极性物质之间，即永久偶极与它诱导出来的诱导偶极之间的作用。分散效应是在多数情况下起主要作用的范德华力，是非极性基团或分子之间的作用力即瞬间偶极间
36、的作用力，即狭义的范德华力，也称London分散力，通常的范德华力就是指这种作用力。范德华力只有当两个非键合原子处于一定距离时才能达到最大，这个距离称为接触距离或范德华距离，它等于两个原子的范德华半径之和。力虽小但数量大。3疏水相互作用 两个非极性基团（疏水基团）为了避开水相而互相聚集的作用称为疏水相互作用。蛋白质分子中的疏水相互作用力主要是由疏水氨基酸的R基团间形成的。是维系蛋白质高级结构的主要作用力。4离子键又叫盐键，是由于正负离子间的静电吸引所形成的化学键，与环境的pH值有关。5配位键在两个原子之间，由于单方面提供共用电子对所形成的共价键，即所谓配位键。金属离子与蛋白质间的连接往往是配位
37、键。6二硫键两个半胱氨酸巯基氧化脱氢所形成的-S-S-桥称为二硫键。它不规定多肽链的折叠，但对蛋白质的三维结构其稳定作用。（三）蛋白质分子的二级结构1二级结构的涵义蛋白质二级结构是指蛋白质主链折叠产生的由氢键维系的有规则的构象。二级结构仅仅是主链构象，不讨论侧链基团的空间排布。这些主链基本构象都是以酰胺平面为基本结构单位。2酰胺平面与二面角肽键具有部分双键的性质，不能自由转动。因此，每个肽单位的六个原子都被酰胺键固定在同一个平面上，这一平面称为酰胺平面，也叫肽平面。它是一个刚性平面，六个原子的相对位置都是固定不变的。3二级结构的基本构象（1）-螺旋-螺旋是蛋白质分子中最常见、最典型、含量最丰富
38、的很稳定的二级结构元件。-螺旋的结构特点主链环绕中心轴按右手螺旋方向盘旋，每3.6个残基前进一圈，每圈前进距离为0.54nm，每个残基占0.15nm；每个残基的亚氨基（NH）与它前面第四个残基的羰基（C=O）氧原子形成氢键，氢键与螺旋轴近乎平行，大量链内氢键维系-螺旋的稳定；-螺旋的结构常用SN表示，S代表每圈螺旋的残基个数，N表示氢键封闭环本身的原子数。3.613。影响-螺旋形成的因素一条多肽链能否形成-螺旋，以及形成的螺旋是否稳定与他的氨基酸组成和序列有极大地关系。R基团小且不带电荷的多聚丙氨酸在pH7的水溶液中能自发的形成螺旋。而带电的多聚赖氨酸则不能形成-螺旋。除R基外，R基的大小对多
39、肽链形成-螺旋也有影响。多聚异亮氨酸在-碳原子附近有较大R基团，造成空间阻碍，因而不能形成-螺旋，多聚脯氨酸的-碳原子参与形成R基吡咯的形成不能形成环内氢键，因此多肽链中只要存在脯氨酸（或羟脯氨酸），-螺旋即被中断，产生一个“结”。（2）-折叠又叫-折叠片或-片层结构，也是蛋白质分子中常见的主链构象之一。所谓-折叠是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折叠构象的肽链，侧向聚集，按肽链的长轴方向；平行并列，形成的折扇状结构。-折叠可分为平行式和反平行式两种。-折叠构象靠相邻肽链主链亚氨基（NH）和羰基（C=O）氧原子之间形成有规律的氢键联结维系的。-折叠片每条肽链称为-折叠股或股。反平行折叠片中重复周
40、期（肽链同侧两个相邻的同一基团之间的距离）为0.7nm，而平行折叠片中为0.65nm。平行-折叠片比反平行-折叠片更规则。平行-折叠片一般是大结构，少于5个股的很少见。反平行折叠片可以少到2个-折叠股。平行-折叠片中疏水侧链分布在折叠片平面的两侧，而反平行-折叠片通常所有的疏水侧链都排列在折叠片的一侧。（3）-转角和-凸起又称-弯曲或发夹结构，在球状蛋白质中发现的一种主链构象。自然界的蛋白质大多是球蛋白，因此多肽链必须具有弯曲回折。-转角是由4个连续的残基组成的，第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键连结，稳定构象。此结构允许肽链作180旋转。由于甘氨酸侧链只有一个H，在-转角中能很好
41、的调整其他残基的空间阻碍，因此是立体化学上最合适的氨基酸，而脯氨酸具有环状结构和固定的角，因此在一定程度上迫使-转角形成，促进多肽链自身回折。目前发现的-转角多处于蛋白质分子的表面。-凸起是一种小片的非重复性结构，能单独存在，大多数经常作为反平行-折叠片中的一种不规则情况而存在。-凸起可认为是-折叠股中额外插入的一个残基，它使得在两个正常氢键之间、在凸起折叠股上是两个残基，而另一侧的正常股上的一个残基。-凸起可引起多肽链方向的改变，但改变的程度不如-转角。（4）无规卷曲或称卷曲，它泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段。无规卷曲并非完全没有规则，它也像其他二级结构那样有明确而稳定的结构，但是它们受侧链相互作用的影响很大。这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。是多肽链不规则，多向性地随机盘曲所形成的构象。也是球状蛋白质中常见的主链构象。球状蛋白质分子的二级结构还不是活性分子的结构形式。在二级结构的基础上在盘曲折叠形成三级结构，有些蛋白质还要由三级结构单位再进一步缔合成四级结构，才能成为具有完整生物功能的活性分子。4、纤维状蛋白质（四）超二级结构和结构域蛋白质分子的折