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1、第35讲 基因工程【课下作业】1(2022广西三市联考)小鼠基因靶向敲除技术是采用工程技术手段使小鼠体内的某一基因失去功能，以研究基因在生物个体发育和病理过程中的作用。例如现有基因型为BB的小鼠，要敲除基因B，可先用体外合成的突变基因b取代正常基因B，使BB细胞改变为Bb细胞，最终培育成为基因敲除小鼠bb。分析答复以下问题：(1)“基因靶向敲除技术采用了基因工程的技术手段。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过_和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性。(2)基因表达载体应包括启动子、_、_、标记基因。目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物_，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗
2、传的关键。(3)为获得“基因靶向敲除的小鼠个体，那么应将同源目的基因导入小鼠的_。此外还必须经过_和胚胎移植等胚胎工程的技术手段，最终由受体母鼠生下来。(4)按上述“基因靶向敲除操作获得的多只雌雄小鼠都是杂合子，人们想在此根底上获得一个含纯合目的基因的个体。简要的方案是：_。答案：(1)体外DNA重组(2)目的基因终止子DNA上是否插入了目的基因(3)受精卵早期胚胎培养(4)让获得的杂合子雌雄小鼠交配，从后代中筛选出含目的基因的纯合小鼠2(2022广州模拟)虫草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。请结合图答复以下问题：注：Hind和ApaL是两
3、种限制酶，箭头表示酶的切割位置。(1)将图中的重组DNA分子用Hind和ApaL完全酶切后，可得到_种DNA片段。图示的表达载体存在氨苄青霉素抗性基因，不能导入用于食品生产的酵母菌中，据图分析，可用_切除该抗性基因的局部片段使其失效，再用DNA连接酶使表达载体重新连接起来。(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因，必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活，因此，图示表达载体上的URA3基因可作为_供鉴定和选择；为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌，所使用的培养基_(填“需要或“不需要)添加尿嘧啶。(3)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为_。为了确定受体细胞中SOD基因
4、是否转录，可用标记的_作探针进行分子杂交检测，分子杂交的原理是_。(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时，需根据所设计蛋白质的结构推测其_序列，最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经基因修饰获得所需的基因。答案：(1)3ApaL(2)标记基因不需要(3)转化SOD基因碱基互补配对(4)氨基酸3(2022海淀区质检)菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。以下图是获得转基因菊花的技术流程，请据图答复以下问题：注：卡那霉素抗性基因(kanR)作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感。(1)为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用_处理土壤农杆菌，使其处于感受态。(2)将
5、重组质粒导入土壤农杆菌的目的是利用农杆菌能够_的特点，使目的基因进入受体细胞中，并插入到菊花细胞的_上，最终形成转基因植株。(3)将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素和_的培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。(4)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据_的核苷酸序列设计特异性引物，以_为模板进行第一轮扩增。解析：(1)用Ca2处理土壤农杆菌，使其处于感受态，易于吸收外源重组DNA分子。(2)农杆菌能够感染植物细胞，并将TDNA转移至受体细胞中，并插入到受体细胞的染色体DNA上，利用这个特点实现导入目的基因。(3)利用添加卡那霉素的培养基可以筛选含卡那霉素抗性基因的转基
6、因植株。(4)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据目的基因的核苷酸序列设计特异性引物，以含目的基因的菊花DNA为模板进行第一轮扩增。答案：(1)Ca2(或“CaCl2溶液)(2)感染菊花(或“植物)细胞，并将TDNA转移至受体细胞染色体DNA(3)卡那霉素(4)抗虫基因(目的基因)转基因菊花的DNA(或“含目的基因的菊花DNA)4(2022武汉调研)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。答复以下问题：(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的_序列发生改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者
7、的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白到达治疗的目的。此操作_(填“属于或“不属于)蛋白质工程，理由是该操作_。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_，以其作为模板，在_酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需在_酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_，用相应的抗体进行_杂交，假设出现杂交带，那么说明该受体菌已合成血红蛋白。解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。(2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，
8、以满足人类生产和生活的需求，题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用反转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原抗体5GDNF蛋白是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的基因表达载体(如下图)，并导入到大鼠神经干细胞，用于神经系统
9、疾病的治疗。请答复以下相关问题：(1)在培养大鼠神经干细胞时，常先用_把组织别离，获得单个细胞。当培养的神经干细胞相互接触后停止分裂，通过分瓶培养可以使细胞继续增殖，该过程称为_。(2)除目的基因、启动子外，基因表达载体通常还含有_，在构建GDNF基因的表达载体时，需选择图中的_限制酶进行酶切。(3)根据上图，酶切后的载体和GDNF基因经_酶处理，可获得_种含有目的基因的产物。解析：(1)动物细胞培养时，需要先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理动物组织，使动物细胞彼此别离成单个细胞。动物细胞培养过程中会出现接触抑制的现象。(2)目的基因的表达载体除了含有目的基因、启动子外，还要含有终止子和标记基因等。
10、从图中可以看出，目的基因的两侧含有限制酶Xho的切割位点，所以要用Xho对质粒和目的基因进行切割。(3)目的基因与质粒的结合要用DNA连接酶处理。从图中可以看出，获得的三种质粒中，只有2种含有目的基因。答案：(1)胰蛋白酶或胶原蛋白酶传代培养(2)终止子和标记基因Xho(3)DNA连接26(2022山东青岛质检)科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请答复以下问题：(1)为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在_的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与结核杆菌中该基因碱基序列_(填“相
11、同或“不同)。(2)通常采用PCR技术扩增MPT64基因，前提是要有一段MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_，在操作步骤中需要加热至9095 的目的是_。(3)根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到_上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的_上。要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有_。(4)研究发现，如果将MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，其保存时间将大大延长，科学家可以生产上述耐储存的MPT64蛋白的现代生物工程技术是_。解析：(1)以mRNA为模板，合成cDNA的过程是逆转录，
12、需要逆转录酶的催化。由于DNA转录形成的mRNA过程中非编码序列不转录，所以形成的cDNA与结核杆菌中该基因碱基序列不同。(2)在PCR技术中，以MPT64基因的核苷酸序列为模板，合成引物。在操作步骤中需要加热至9095 ，以翻开目的基因DNA的双链。(3)在农杆菌转化法中，将MPT64基因插入到农杆菌的Ti质粒的TDNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞，并将其插入到植物细胞中的染色体的DNA上。基因的表达产物是蛋白质，要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有MPT64蛋白。(4)蛋白质工程又叫第二代基因工程，可以通过设计改造原有蛋白质的结
13、构和功能，来满足人类的生产和生活需求。答案：(1)逆转录酶不同(2)引物使目的基因DNA受热变性解旋为单链(3)Ti质粒的TDNA染色体DNAMPT64蛋白(4)蛋白质工程7(2022黑龙江哈尔滨三中模拟)绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对 TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于 TMV 的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如下图。(1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中过程表示 _，获得的DNA必须在两侧添加_和_。 (2)过程构建重组Ti 质粒时，必须使用
14、_和_两种工具酶。 (3)由图分析，在过程构建的重组Ti质粒上应该含有卡那霉素抗性基因作为_，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是_。(4)在过程培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加_，以保证受体细胞能培养成再生植株。(5)过程可采取_的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过_的方法来确定植株是否具有抗性。 解析：利用mRNA获得目的基因的方法是逆转录法，目的基因的两端要分别有启动子和终止子。质粒上的抗性基因常用作标记基因。检测目的基因是否完成了表达常用抗原抗体杂交的方法检测是否合成了特定的蛋白质；常用接种实验从个体水平上检测植株是否具有抗病
15、性。答案：(1)逆(反)转录启动子终止子(2)限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶(3)标记基因农杆菌转化法(4)植物激素(生长素和细胞分裂素)(5)抗原抗体杂交接种烟草花叶病毒8(2022江西新余联考)人参是一种名贵药材，具有良好的滋补作用。口服干扰素在慢性乙肝、丙肝及局部肿瘤的治疗中有一定疗效。以下图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程，表示相关的操作，EcoR、BamH为限制酶，它们的识别序列及切割位点如表所示。请答复以下问题：限制酶识别序列和切割位点EcoRGAATTCBamHGGATCC(1)步骤中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是_。科研人员
16、还在两种引物的一端分别加上了_和_序列，以便于后续的剪切和连接。(2)过程所构建的基因表达载体中未标注出的必需结构还有_，过程中需先用_处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)过程中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过_过程获得DNA，再进行PCR扩增，假设最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是_。(4)治疗中发现，用于口服的干扰素在胃中会受到一定程度的破坏影响其成效，需要利用_技术加以改造，以到达满意效果。解析：(1)设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的局部核苷酸序列。后期需要用限制酶进行切割，所以在两种引物的一端分别加上了GAATTC和GGATCC序列。(2)构建的基因表达载体中还需要复制原点。过程中需先用Ca2处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。(3)RNA通过逆转录形成DNA，假设最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录。(4)对干扰素进行改造需要利用蛋白质工程。答案：(1)干扰素基因两端的局部核苷酸序列GAATTCGGATCC(2)复制原点Ca2(3)逆转录干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞或导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录 (4)蛋白质工程