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1、重组质粒的构建实验流程 质粒构建基因提取 1、2、3基因提取 1、2、3PCR 反应扩增目的基因4、3PCR 反应扩增目的基因4、3DNA片段回收 5、3DNA片段回收 5、3重组质粒检测：（1）PCR (2) 双酶切 8 、5重组质粒检测：（1）PCR (2) 双酶切 8 、5测序测序重组质粒提取 2 、 3重组质粒提取 2 、 3菌种保藏 7菌种保藏 7目的片段与载体连接及转化6目的片段与载体连接及转化6名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 12 页 - -
2、 - - - - - - - 实验操作1、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子， NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。【试剂】胰蛋白胨（ Tryptone）、酵母提取物（ Yeast Extract）、 NaCl、琼脂（ Agar）【实验步骤】1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 12 页
3、 - - - - - - - - - 胰蛋白胨（ Tryptone） 1g酵母提取物（ Yeast Extract） 0.5g NaCl 1g琼脂（ Agar） 1.5g单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。2、 液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。4、 灭菌将上述培养基以 1.05kg/cm2、121.3、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4冰箱内暂存。
4、灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4保存。5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于 55的水浴中，待培养基温度降至55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。倒板：一般 10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 1015min。保存 :将培养皿倒置放于 4保存，一个月内使用。二、质粒的提取（protocol ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - -
5、 - - - 第 3 页，共 12 页 - - - - - - - - - 1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的 LB 液体培养基中， 37过夜培养。【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。】2、5ml菌液倒入 5ml离心管中， 10,000 xg，1min离心，弃上清。（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心2min）【注：rmp（转速）与rcf= g（相对离心力）,RPM 只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM 是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同
6、的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。】3、加入 250ul Solution （使用前加入RNase A1，冰箱 4冷藏），充分悬浮细菌沉淀。【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex等剧烈震荡使菌体充分悬浮。】4、加入 250ul Solution 【裂解细胞】（提前放入37孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合 56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。【注：此步骤不宜超过 5min】5、加入350ul Solution 【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块。6、将上面液体倒入 1.5ml的EP 管中， 13,000 xg，10min离心。7、将上述离心
7、得到的液体倒入柱内，10,000 xg，1min离心，弃液体。8、加入 500ul bufferHB，10,000 xg，1min离心，弃液体。9、加入 700ul DNA wash buffer （提前加入指定体积的100%乙醇），10,000 xg，1min离心，弃液体。（重复一次）10、空离， 13,000 xg，2min离心。11、将离心柱放入 1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。12、加入 60ul ddH2O（提前在 60水浴箱内预热），60摇 2min。13、13,000 xg，1min离心，得液体。14、测浓度。15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注：提好
8、的质粒需标明时间、名称等，-20保存。】名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 12 页 - - - - - - - - - 3ul 质粒（ DNA） 10 xLoadingBuffer 1xTAE3ul 1ul 6ul6ul 质粒（ DNA） 10 xLoadingBuffer 20ul 2.2ul 三、琼脂糖凝胶电泳【试剂】琼脂糖（ Agarose）， 1xTAE 电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA GelStain）,DL2000 DNA Mark
9、er, 10 xLoading Buffer【实验步骤】1、配置 50ml（大样）、 25ml（小样）， 1.5%的琼脂糖凝胶。称取 50 x1.5%=0.75g 琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE 缓冲液，染料 2ul（边加染料边倒 TAE 缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低档， 5min）3、插入梳子，倒入制胶槽中。4、放在抽屉里室温、避光静置20min。5、按下表加样。适用于检测 DNA（小孔）：Marker（DL2000）样品适合回收DNA(大孔)Marker（DL2000）样品6、120V，电泳
10、 25min左右。7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。新建 选染料（ SyBR safe ）选颜色（ SyBR Green ）勾除高亮选项 检测 文本注释 (字体14，颜色白色 )保存名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 12 页 - - - - - - - - - （酶切后的质粒会出现两条色带，上面的一条是载体较暗，下面的一条是目的质粒较亮，根据Marker显示，证明是否是所需质粒）【注】1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10 xLoadingBuffer均
11、加1ul。2、电泳的加样空宽度小于6mm时，每次取 5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样空增宽，需适当增加Marker制品的加样量。3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。4、进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。6、若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。7、 实验室有两种常用的Marker分别为 DL2000 DNA Marker和-EcoT14digest DNA Mark
12、er。琼脂糖电泳图像示意图如下：四、 PCR【试剂】灭菌水、 10 xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS ）、引物（上、下）Taq DNA 聚合酶、模板 DNA（质粒）【操作步骤】加样前应先打开PCR 仪预热。1、在0.5mlPCR 管中加入依次下列试剂：25ul体系（ EGFP 扩增）：灭菌水： 9.5ulLA混合物： 12.5上引物： 1ul下引物： 1ul模板 DNA（PCDHA ）： 1ul总体积： 25.0ul名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共
13、 12 页 - - - - - - - - - 2、将上述 PCR 反应混合物放入 PCR 仪中。3、设定程序进行扩增：94变性 5min后，开始以下循环94变性 -30s55退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）-1min72延伸 -30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）共30个循环最后循环结束后 72反应 7min，4冷却。4、PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】1、当PCR 反应后的产物目的片段还需要进行后续操作时，选用LA Taq酶；当 PCR 反应用于检测时选用EX Taq 酶。2、buffer的选择应与酶的选择相对应，例如：LA Taq酶对应的 buffe
14、r为10 xLA PCR Buffer 。3、在PCR 小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。这样既节省时间，又节省枪头。五、 PCR产物的回收纯化1、将PCR产物稍微离心片刻。2、将PCR扩增产物转移至 1.5ml EP管中，然后加入 4-5倍体积的 BufferCP,若PCR产物 200bp则加入 6倍体积的 Buffer CP。3、充分振荡混合。4、然后转移至 DNA 离心柱中， 10,000 xg离心1min，倒回重复一次，弃名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - -
15、- 第 7 页，共 12 页 - - - - - - - - - 液体。5、加入 700ul的DNA Wash Buffer ，10,000 xg离心1min ，弃液体。6、空离， 13,000 xg，2min离心。7、将离心柱放入 1.5mlEP管内，吹风吹干。8、加入 15-30ul ddH2O（提前在 60水浴箱内预热），60摇2min。9、13,000 xg，1min离心，得液体。六、与 T载体连接10ul体系2xRapid Ligation Buffer ，T4 DNA Ligase 5ulPGEM-T Easy Vector（50ng） 1ulPCR product（150ng）
16、150/C ulT4 DNA Ligase 1ulWater 3-150/C ul总体系 10ul放入 4冰箱内过夜。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 12 页 - - - - - - - - - 七、 DNA片段的回收纯化【实验步骤】1、实验前将水浴锅调到55-60，将灭菌水 60水浴锅内预热。2、使用 TAE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。3、在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切
17、除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA的回收率。（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤，先切后验证。）4、切碎胶块。5、向胶块中加入胶块融化液Binding buffer 500ul 。6、均匀混合后 55-60加热融化胶块 7min，此时应间断振荡混合。（注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA的回收率。）7、将上述胶块融化液倒入柱子内，10,000 xg 1min离心，倒回，重复一次。8、加入 300ul Binding buffer ，10,000 xg 1min离心，弃滤液。9、加入 700ul DNA wash buffer ，10,
18、000 xg 1min离心，弃滤液。10、空离， 13,000 xg，2min离心。11、将离心柱放入 1.5mlEP管内，吹风吹干。12、加入 30ul ddH2O（提前在 60水浴箱内预热），60摇 2min。13、13,000 xg，1min离心，得液体。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 12 页 - - - - - - - - - 八、目的片段与载体的连接及转化【试剂】PMD-18载体、目的片段、 Solution、感受态细胞、 LB液体培养基（加氨
19、苄青霉素抗体 AMP）、含AMP的LB固体培养基【实验步骤】1、连接、实验前水浴准备。、在 PCR 管中加入： PMD-18 载体 1ul目的片段 4ul总体积 5ul、再加入 5ul的Solution、16，连接 90min2、转化、全量 10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40min。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 12 页 - - - - - - - - - 、42水浴锅内热激 90s（让质粒进入感受态细胞）。、取出冰上放置 5min（让感受态细胞
20、关闭）。、加入 200ulLB液体培养基（无抗体AMP），37摇床培养 1h。3、涂板将上述培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。（3ml培养基中加入 3ulAMP）4、挑菌第二天晚上五点左右挑菌，在5ml LB液体培养基（加 5ul AMP）中摇床培养， 37过夜。（5ml LB培养菌 +5ulAMP+用枪头挑菌，枪头可打入培养瓶中）5、第二天提取质粒。或6、保藏、实验前超净台灭菌。、将 500ul50%的甘油与 500ul菌液混合， -80保存。九、双酶切反应【试剂】Buffer2.1、限制酶（ EcoR ）、限制酶（ BstB）、重组质粒（plasmind）、灭菌水【实验步骤
21、】1、实验前水浴准备。2、在0.5ml的PCR 管中加入下列试剂：体系：灭菌水： 20ul-V其他 Buffer2.1： 2ul BSA ： 0.2ul名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 12 页 - - - - - - - - - 质粒： 1ug/CEcoR ： 0.5ulBstB： 0.5ul总体积： 20ul（注：黑色加粗部分的体积不随总体系体积的变化而变化，既保持恒定不变。）3、37水浴， 2-4h。4、琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。【注】1、酶的选择：载体上有酶切位点，但目的片段上没有该酶的酶切位点，且选择的酶为常用酶。2、Buffer的选择：需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。相关资料请查询双酶切通用缓冲液使用表。例：若选用BamH、 Hind，则buffer选用10 xK。3、反应温度的选择：需要参考所选的酶，必须同时适用于两种酶。相关资料请查询 TaKaRa 中文目录。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 12 页 - - - - - - - - -