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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料分子生物学学问点总结1.蛋白质组 proteome ：proteins expressed by a genome, 即基因组表达的全套蛋白质；蛋白质组学（Protemics ）就是以蛋白质组为讨论对象,从整体角度,分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学；（相 互作用网络 PPI）2.表达蛋白质组学讨论的基本流程：蛋白样品的制备及定量- 总蛋白的双向凝胶电泳（染色） - 凝胶分析软件分析 - 胶内酶解（胰肽酶） - 质谱分析（肽质 量指纹图谱） - 数据库搜寻鉴定蛋白性质3.4.双向凝胶电泳： 相互垂直的两个方向
2、上,分别基于蛋白质不同的等电点和分子量,先经等电聚焦电泳 isoelectric focusing , IEF ,再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分别；比较蛋白质组学： 通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异,发觉与肿瘤发病或 者进展有关的分子标记,用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白；5. 6.软电离：所谓“ 软电离” 是指样品分子电离时保留整个分子的完整性,不会 形成碎片离子；肿瘤血清蛋白质分析方法 （tumor serologic proteome analysis, SERPA）：是从肿瘤免疫学观点
3、动身建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法；SERPA其试验过程如下：双向电泳分别肿瘤组织（细胞）总蛋白质；转膜；建立 western blotting蛋白质印迹反应图谱 （与患者或正常人血清反应） ；软件分析确定差异反应的蛋白质斑点；质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶replica gel中相应的差异蛋白质点进行鉴定,挑选出肿瘤分子标志物；用 ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证,或者进一步分 析该蛋白功能,讨论其在肿瘤进展中发挥的作用；7. 蛋白质芯片 ：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面,形成微阵列,依据蛋白质分子间特异性结合的原理,构建微流体生物
4、化学分 析系统,以实现对生物分子的精确、快速、大信息量的检测；功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与 DNA/RNA间的相互作用的讨论；8.以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要讨论内容,由此 建立细胞内外信号传递的复杂网络；讨论方法主要有：蛋白质芯片技术 目前常用蛋白质芯片有：1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片 噬菌体展现技术 酵母双杂交系统 免疫共沉淀名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 9.名师精编优秀资料免疫共沉淀（ Co-Immu
5、noprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于讨论蛋白质相互作用的经典方法；是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法；10. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：依据蛋白质分子量不同分别复杂蛋白质成分； 1. 制备凝胶试剂：丙烯酰胺（单体） ；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例 29 ：1；母液浓度 30%；过硫酸铵（引发剂引发交联）； N,N,N, N-四甲基乙二胺 （ TEMED） 加速剂 十二烷基磺酸钠 （SDS）（阴离子变性剂）2. 蛋白上样缓冲液 3. 电泳缓冲液4. 考马斯亮蓝 R250染色液 5. 脱色液11. Western blotti
6、ng 基本原理 : 将 SDS-PAGE分别的蛋白质转移至 硝酸纤维素膜nitrocellulose membrane 上, 在膜上进行固相免疫化学染色 , 原位显示蛋白质带 , 从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析；12. Southwestern blotting 基本原理 : 细胞核蛋白提取物经 SDS-PAGE后, 转移至NCM上, 然后用 标记的 DNA探针 检测转移至膜上的蛋白质；细胞死亡形式表现细胞死亡并非与机体死亡同步；正常组织Cell death细胞生命现象不行逆的停止细胞结构和功能的不行逆丢失；中也发生细胞死亡,它是维护组织机能和形状所必需的；细胞坏死 细胞受
7、到外来的急性的强力的致病因素作用下,细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“ 意外” 的、被动性死亡过程；只见于病理情形下；细胞肿胀,线粒体和内质网肿胀；核染色质随机降解呈絮状 , 蛋白合成削减；细胞膜、溶酶体破裂 , 细胞内容物流出 , 引起四周炎症Apoptosis 指在肯定的生理和病理条件下,多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳固,由基因掌握并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程 . 又程序性细胞死亡 programmed cell death,PCD. 凋亡小体：胞膜皱缩内陷、反折,包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分别脱落,形成一些有膜包被,内涵物不外溢的小块,称凋
8、亡小体（apoptotic body）；PCD: 多细胞生物体在生长发育过程中,细胞在基因调控下,依据肯定时空次序发生的受到严格程序掌握的生理性死亡；“ 特别的定时自杀” PCD Apoptosis功能性概念 发育学概念 形状学概念仅存在于发育细胞 可存在于发育和成体细胞大部分凋亡是 PCD；PCD的最终结果是凋亡某些凋亡是非程序性；如细胞毒物诱导的凋亡13. 凋亡的生物学意义 1、确保正常生长发育、2、维护内环境稳固、3、防备功能14. 细胞凋亡的 形状学特点 ：细胞皱缩 ;2. 细胞质浓缩 ;3. 染色质边集核膜下,呈块状、新月形,4. 凋亡小体形成； 5.凋亡小体内有结构完整的细胞器；名
9、师归纳总结 细胞凋亡的 生化特点 ：染色质 DNA片段化内源性核酸内切酶活化,将核小体间的连接DNA降解,形成长度为 180第 2 页,共 12 页200bp整倍数的寡聚核苷酸片段；在琼脂糖凝胶电泳中呈特点性的“ 梯状” 条带（DNA ladder ：细胞凋亡时 DNA在核小体间断裂 DNA fragmentation 形成 一些 DNA片断,经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生n 条梯状条带,故称之为DNA Ladder,是判定 DNA损耗的重 要标准 ）- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料15. Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白
10、水解酶,是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用的,活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶；Caspase功能： 1. 细胞骨架蛋白和核纤层蛋白,导致细胞解体成凋亡小体2 激活 DNA酶（ Caspase-activated DNase,CAD）；CAD:Caspase激活的 DNA酶正常情形下 CAD与其抑制剂 ICAD结合,在胞质内,无活性；凋亡时 Caspase水解 ICAD, 游离的 CAD有活性,进入胞核,切割DNA；）3 灭活凋亡抑制物 : 如 Bcl-2 、 ICAD 4 水解与 DNA损耗修复相关的酶和蛋白质 如聚 ADP核糖多聚酶（ poly-ADP-ribose polymera
11、se,PARP16. 死亡受体途径 - 外源性途径：死亡受体 TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、DR5等是一类通过与相应配体结合,传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白；通路（pathway）死亡配体（细胞外） - 死亡受体（细胞膜） - 相关蛋白（中介蛋 白,细胞质内） - 激活 Caspase8激活 Caspase3- 细胞凋亡17. 线粒体损耗途径 - 内源性途径：线粒体是细胞生命活动的掌握中心,它不 仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,而且是细胞凋亡的调控中心；释放细胞色素 C（Cyt.c ）释放凋亡诱导因子（ apoptosis inducing factor ,AIF）和
12、限制性核酸内切酶 G（Endo G）释放 Smac/Diablo the second mitochondria-derived activator of caspase,Smacdirect IAP bingding protein, Diablo 18. 细胞周期 ：1.G1 期（first gap）从有丝分裂 到 DNA复制前的一段时期,又称合成前期,此期主 要合成 RNA和核糖体 ；该期特点是 物质代谢活跃,快速合成 RNA和蛋白质,细胞体积显 著增大；这一期的主要意义在于为下阶段 S 期的 DNA复制作好物质和能量的预备；2.S 期（synthesis ）即 DNA合成期,在此 期,
13、除了合成 DNA外,同时仍要合成 组蛋白 ；DNA复制所需要的酶都在这一时期合成； 释放活性氧 ROS 3.G2 期（second gap）期为 DNA合成后期,是有丝分裂的预备期；在这一时 期,DNA合成终止,大量合成 RNA及蛋白质,包括 微管蛋白 和促成熟因子 等；4. M 期：细胞分裂期；19. 细胞周期蛋白或周期素（ Cyclins ：一类结构类似、能结合并调剂 CDK活性 的蛋白家族, 哺乳动物至少有 10 种,14 个成员（cyclin A、B1-2、C、D1-3、E、F、G1-2、H、I 、K）；cyclins-CDKs-CKIs 20. HIF-1a ：几乎参加了对糖酵解每一
14、步的调控；系统 PI3K/Akt 途径； Myc；P53等名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料21. Cyclin ：周期素 / 周期蛋白,是 CDK（周期素依靠的蛋白激酶）的调剂亚基,分别在细胞周期的不同时期积存,激活 CDK,使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调剂其活性；参加细胞周期中不同时相的调剂；22. G1/S 检验点 ：在酵母中称 start点,在哺乳动物中称 R点restriction point ,掌握细胞由静止状态的G1进入 DNA合成期,相关的大事包括：DNA是否损耗？细胞外环境
15、是否相宜？细胞体积是否足够大？23. cyclin box：各类周期蛋白 均含有一段约 100 个氨基酸的保守序列 ,称为周期蛋白盒 cyclin box,是与 CDK相互作用的活性区域；24. RNA干扰 RNA interference ,RNAi 是将双链 RNA导入细胞内引起特异基 因的 mRNA降解的一种细胞反应过程；属于转录后基因缄默的一种；25. 试述 CDK1活性的调控机制？CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调剂；激活因素中,目前 认为 CDK与周期素的结合 以及保守的苏氨酸残基的磷酸化 是较为重要的两种 调剂因素；抑制因素中, CDK的 N-端氨基酸残基的抑制性磷
16、酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调剂因素；磷酸化修饰的激活作用 ：CDK的激活仍必需依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化,如在人 CDK1（p34cdc2）的 Thr161 和CDK2的 Thr160 的磷酸化,就与这两个酶的激活相关；催化 CDK1和 CDK2磷酸化的酶是 CAK（CDK activiting kinase ）,是另一种蛋白激酶 CDK7-Cyclin H复合物；当磷酸酶 -1 将此位点的磷酸水解, P34cdc2 又失去激酶活性； 磷酸化修饰的抑制作用 在人的 CDK1和 CDK2中, Thr14 和 Tyr15 残基的磷酸化可抑制 CDK的催化活性； 催化 Thr14 和 Ty
17、r15 磷酸化的是两种不同的蛋白激酶,使 Thr14 磷酸化的为蛋白激酶Myt1 ,使 Tyr15 磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1；催化 Thr14 和 Tyr15 脱磷酸化的是蛋白磷酸酶 CDC25；26. DNA损耗又称基因突变：是 DNA复制过程中发生的 DNA核苷酸序列的转变,从分子水平看是 DNA分子碱基次序或数目的转变；突变的形式包括：替换、插入、缺失、重排；27. 突变形式：（一）点突变：指 DNA分子上一个碱基对的变异, 碱基替换包括：转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞贫血,碱基颠换 AT-TA；（二）插入和缺失 - 框移突变（ frame-shift mut
18、ation）: 缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式转变, 造成蛋白质氨基酸种类、 排列次序发生转变； 地中海贫血 （三）重排：指 DNA分子内发生较大片段的交换,也称重组；移位的 DNA片 段可在新位点颠倒方向反置（倒位） ,也可在染色体之间发生交换重组；突变的意义：产生新基因,显现新性状,为生物进化供应了最原始、最根本 的的材料,是进化的分子基础28. DNA损耗的修复：指针对已发生的缺陷而进行的补救机制；直接修复：修复酶识别出损耗部位直接修复,不用切除 DNA或切除碱基；包括 1. 光修复、 2. 链断裂的直接重接、 3. 碱基的直接插入、 4. 转甲基作用切除修复 excission
19、repair：在 DNA内切酶、外切酶、 DNA聚合酶、 DNA连接酶等多种酶的共同作用下, 先将 DNA受损的单链部位切除, 然后以另一条链为模板,合成一段正确配对的碱基序列来修补缺口；切除修复的特点：（1）切除修复利用的是化学能 生在复制前；（3）修复的对象是亲代 DNA；DNA损耗最普遍的修复形式；ATP,也叫暗修复；（2）修复发名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料重组修复： 当 DNA损耗较大、较严峻,无法准时修复或缺乏切除修复酶系统,可跳动损耗部位复制,子链形成缺口,复制终止后,在重组基因
20、 rec 编码的酶（Rec蛋白）、DNA聚合酶、 DNA连接酶等的作用下,将无损母链的 DNA片段移到子链缺口,进行重组修复；发生在复制后,故又称“ 复制后修复”DNA损耗重组修复的过程及特点：过程：（1）复制：损耗母链复制时,越过损伤部位,子链对应位点留下空缺；无损母链复制成完整双链；2 重组：空缺诱导产生重组酶 Rec 蛋白 , RecA 与空缺区结合,并催化子链空缺与无损母链相应片段重组交换RecBCD蛋白; 有缺子链与无损母链重组,空缺转移到无损母链,有缺子链完整,损耗母链仍旧保留； 3 再合成： 转移后的母链空缺以新的互补子链为模板,酶的催化下,重新修复缺口 ; 在 DNA聚合酶和连
21、接DNA链的损耗并未除去,随着复制的连续,损耗链将在群体中逐步“ 稀 释” ；修复发生在复制后,对象是子代 DNA. SOS修复： DNA严峻损耗难以复制或DNA复制系统受抑制的紧急情形下,为了保证 DNA链的完整性, 应急产生校对功能低的修复酶, 采纳填补任意碱基的修复方 式；这是具有差错的修复, 是对极为不利的外界环境的应急反应,故称 SOS修复,也 称差错倾向修复； SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物；细胞能存活,但变 异率高, DNA保留错误较多,会引起广泛、长期的突变；自然界也因此而变得生 物种类繁多；信号转导通路29. 受体：是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（
22、配体）并 能激发靶细胞产生特异生物效应的特别蛋白质分子；G蛋白： 广义的 G蛋白是指全部能与GTP或 GDP结合的蛋白质；细胞信号转导中扮演重要角色的 G蛋白主要有两类： 异三聚体 G蛋白（与膜受体偶联,位于细胞膜内侧,由三个亚基组成,一般称为经典G蛋白或大 G蛋白；）、单体 G蛋白（ 存在于不同的细胞部位的小分子量 G蛋白,也称为“ 小 G蛋白” ,是单亚基蛋白；Ras 是第一个被发觉的小 G蛋白；）SH2结构域： 由约 100 个氨基酸残基组成,中心为反向平行的 片层结构,两侧为 螺旋；SH2介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合,并与磷酸化酪氨酸的磷酸基团结合；这种结名师归纳总结 合依
23、靠于酪氨酸残基的磷酸化及其四周的氨基酸残基所构成的模体（motif ）；不同的蛋白质分子第 5 页,共 12 页含有结构相像但并不相同的SH2结构域,因此对于含有磷酸化酪氨酸残基的不同模体具有挑选性；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料SH3结构域： 由 55-75 个氨基酸残基组成 , 形成一个扭曲 桶状结构； SH3结构域介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合,构成的模体序列相关；其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨基酸残基所30. 1. 简述细胞膜受体的类型及其特点：2. 举例说明 cAMP-PKA信号传递途径；cAMP对肌细胞中糖原分
24、解合成的调剂作用肾上腺素肾上腺素分泌,与膜受体结合,通过G 蛋白偶联激活腺苷酸环化酶催化ATP生成 cAMP ,cAMP通过激活 PKA（依靠 cAMP的蛋白激酶）行使功能,PKA* 3. 试述 RTKRasMAPK信号传递途径；该途径的信号分子：生长因子类 EGF、PDGF、IGF、FGF、VGEF等RTK：受体酪氨酸激酶（与配体结合及受体二聚化 / 寡聚化使酶激活）Ras蛋白：Ras 蛋白是细胞内的一种小分子单体GTPase,像其它单体 GTPase和 G蛋白三聚体一样,非活化状态时结合GDP,在外源信号的作用下释放GDP,结合GTP,本身即被激活, Ras蛋白亦具有 GTPase活性,将
25、 GTP水解成 GDP, Ras 蛋白本身又回到非活化状态；但Ras蛋白水解 GTP的速度比 Gs 至少慢 100 倍；名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料MAPK：有丝分裂原活化蛋白激酶或微管相关蛋白激酶,属 Ser/Thr 激酶,是接受膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子,在多种受体信号传递途径中具有 关键性作用；名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料31. 抑癌基因 （tumor s
26、uppressor gene）：又称为抗癌基因（ antioncogene ）是 一类在正常情形下对细胞增殖有 负调控 作用,而在两个等位基因都缺失或失活时可促进肿瘤形成的基因；常见的有p53、Rb、VHL、APC 32. p53 的功能 ：（1）抑制 cyclin A 的表达；（2）抑制 DNA聚合酶与 DNA复制起 始复合物的结合 ；（3）激活抑制细胞分裂的基因 ；（4）抑制癌基因对细胞的 转化；33. 基因诊断 : 采纳分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构 DNA水平 或功能 RNA水平 是否反常,以此来对相应的疾病进行诊断；是 病因的诊断；分子生物学相关试验34. PC
27、R-RFLP：多聚酶链式反应 - 限制性片段长度多态性分析,靶基因 PCR扩增、扩增的 DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性） ；主要用于核酸变异性分析 与比较；35. PCR-SSCP（诊断有无突变） ： 聚合酶链反应 - 单链构象多态性分析 single DNA片段 strand conformation polymorphism 的简称,原理是将经扩增的 经过变性处理 ,形成单链 ,由于序列不同,单链构象就有差异在中性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳的 迁移率不同 ,通过与标准物的对比, 即可检测出 有无突变 ；广泛应用于检测各种病原体基因的 并不能鉴别全部的突变；点突变及缺失突变, 基因的多态性
28、分析等 ；36. PCR-southern blot 或 Dot blot 技术：是将 PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜 或尼 龙膜上,再与标记的特异性探针进行杂交,然后放射自显影,来检测 有无特定的扩增片段及相对含量,现已广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的讨论及检测；37. 核酸分子杂交：依据碱基互补配对原就,将不同来源的序列互补单链的 DNA/DNA,RNA/RNA,互补配对成双链杂交分子,这一过程叫核酸分子杂交；38. 原位杂交：用核苷酸探针对特别的核苷酸次序在其原位进行in situ DNA的hybridization杂交, 叫原位杂交；可用于DNA、RNA定位讨论；
29、39. DNA印迹技术 Southern blotting：Southern 印迹杂交常用于探测限制性内切酶图谱；通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图名师归纳总结 谱的变化,可判定是否发生了明显的DNA突变；第 8 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料PCR过程及原理： 又叫体外基因扩增技术；利用人工合成的一对引物,在被扩增 DNA模板链的两端形成双链,由 DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应；组成体系： template DNA.at least a couple of primer（长度： 20bp 左右
30、 ; 碱基分布 : 匀称随机, G+C含量:40-60%; 引物自身不存在发卡结构 ; 两个引物间不能互补；引物与非特异靶区段同源性不能超过 70%；5端可修饰（酶切位点）-便利基因隆 ）；Taq酶；四种底物 dNTPs；buffer （包括 Mg2+）；过程： 变性：将双链DNA 加热（ 95）使之变性, DNA 双链 变成单链 退火：降低温度至56使引物与模板DNA单链结合 延长：将温度升至 72,在 DNA聚合酶作用下, 在引物 3 端进行延长,使原模板 DNA的一条链变成两条链；Taq 酶的特性： a 耐热 b 缺乏校正活性 3 - 5外切酶活性 ,相对简洁错误掺入 c 合成速度 :1
31、200bp/min d 在新链 3- 端额外加上一个 A e 有 5- 3外切酶活性,可以 real time PCR 40. DNA芯片技术：是指将 很多特定的 DNA片段或 cDNA片段作为探针 ,有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上；41. 基因转移的方法： 1. 逆转录病毒载体（生物学） ；2. 脂质体； 3. 直接注射；4. 受体介导基因转移技术；8. 显微注射法；5. 磷酸钙共沉淀法； 6. 电穿孔法； 7. 基因枪法；42. RNAi（RNA interference）：是指在生物体细胞内, 短双链 RNA（dsRNA）引 起同源 mRNA的特异性降解 ,因而抑制相应基因表达
32、的过程；一种转录后水 平的同源靶基因缄默, RNAi能达到基因敲除的成效；43. SiRNA制备方法比较44. 基因工程一般步骤： 1. 分别目的基因（化学合成、制备 DNA文库、制备基因组文库、 PCR）；2.DNA切割（限制性内切酶 接；4. 转化：vector 和目的基因片段）；3. 连b）E.Coli 细胞转化 :CaCl2 法制备感受态细菌名师归纳总结 a真核细胞转化 : 第 9 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - b c名师精编优秀资料micro-injection 微注射 细胞核大 磷酸钙共沉淀法 贴壁细胞 d electr
33、oporation 电穿孔 , 电激 , 电击 悬浮细胞 e 基因枪 贴壁细胞 / 组织块 f liposome 脂质体 5. 挑选重组体：蓝白挑选 - 互补法 ；养分缺陷互补法；抗生素抗性互补；gene manipulation 45. Expression vector ：就是在克隆载体的骨架的基础上增加表达原件,如启动子、目的基因、终止子、标记基因,使目的基因能够表达的载体；46. Plasmid ：质粒,指一种小环状 DNA分子,存在与细胞染色体外,能够自主复制产生特定的功能；47. LncRNA：长链非编码 RNA,由基因组编码产生,长度大于 200 个核苷酸,没有编码蛋白的才能；4
34、8. Palindrome ：回文序列,也叫作反向重复序列,指核酸序列的 5-3 方向与其另一条链相同；49. CRISPR：是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制,Cas9 蛋白有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA的两条单链； Cas9 先与 crRNA及 tracrRNA 结合成复合物,然后通过 PAN序列结合并侵入 DNA,形成 RNA-DNA复合结构,进而对目的 DNA双链的切割,使 DNA双链断裂；50. 基因工程常用的酶：限制性内切酶、反转录酶、Taq DNA polymerase51. 请设计一个QRT-PCR试验,简述其原理,过程；（可以结合文献,举例说
35、明）；qRT-PCR：（荧光定量PCR）在 PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积存实时监测整个PCR进程中每一轮循环产物的累积数量,最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；逆转录 - 聚合酶链反应,提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用 Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA. 反应体系： SYBR Premix Ex Taq：含有 TaKaRa Ex Taq, dNTP mixture, Mg2+, SYBR Green I 等；52. 请设计一个载体,在大肠杆菌细胞中表达一个目的基因（举例说明）；Recombinant DNA Tech
36、nology-Process of cloning : 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料1. Isolation of target gene（分别目的基因）2. Selection and construction of vectors 3. Ligation of target DNA and vector（载体的挑选和构建）（载体与目的基因结合）提取质粒,限制酶切割质粒,用限制酶从其他组织切割目的基因暴露粘性末端；载体与目的基因结合得到重组质粒,重组质粒导入 E.coli 中4. Tra
37、nsformation of target gene into receptor cell （目的基因导入受体细胞）Introduction: transformation E.colitransfection Tumor cellsinfection Virus；5. Screening for recombinant plasmids（重组质粒的挑选）6. Expressing a cloned gene（克隆基因的表达）53. 内含子： 真核生物细胞DNA中的间插序列；含调控序列,参加基因表达；54. 外显子： 为蛋白质氨基酸编码的 DNA序列；55. 基因组： 一个细胞或者生物体所携带
38、的一套完整的单倍体序列,包括全套基因和间隔序列；56. 真核细胞基因组的特点DNA量大、断裂基因 / 含有内含子和外显子、重复序列（显现缘由：基因的多拷贝、与染色质的构象着丝点的形成有关、参加表达调控,染色质 DNA的“ 区间性” ）、不存在操纵子结构、57. 微卫星 microsatellite：遍布于人类基因组的短小重复序列,每一重复序列为 1bp 6bp,重复次数不超过 60 次,片段长度小于 350 bp ；58. 操纵子 operon ：由功能相关的一组结构基因 structural genes 串联在一起,包括上游的调控区共同构成；59. 试述转录前水平的表达调控的方式：基因丢失（
39、体细胞分化过程中,必需将某些基因永久性关闭；最简洁有效的方式是将这些基因丢失；将要分化为生殖细胞的细胞就始终保留着整套基因组）、扩增（发育分化、环境条件的转变,对某些基因产物的需要量急剧增加增加该基因的拷贝数）、重排（某些基因片段转变原先存在的次序重新排列组合； ）、甲基化修饰（脊椎动物中,发生甲基化修饰（5mC）、染色体结构；DNA上特定的 CpG序列处 C 可60. CpG island ： 具有 CpG二核苷酸簇的 500 碱基的区域 至少 55% G+C含量, 0.65 或更大比率的观看和预期o/e CpG 二核苷酸频率 ,定义为 CpG岛；61. 顺式调控元件 cis-acting
40、element,CAE ：基因四周能与特异转录因子结合而影响转录的 DNA序列；包括启动子 （ 与 RNA聚合酶结合并起动转录的 DNA序列）、增强子、 缄默子；62. 增强子 enhancer ：增强启动子功能,促进基因转录活性；必需与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用；作用方式 ：具有组织特异性；无基因特异性；无方向性；可位于上下游远距离作用； 3000bp具有相位性；具有一定空间相位；63. 反式作用因子 trans-acting factor：由位于不同染色体或同一染色体上相距较远的基因编码的蛋白质因子；结构：一个完整的反式作用因子含有 2 个必不行少的结 构 域 , 即 D
41、NA 结 合 结 构 域 DNA binding domain 和 转 录 活 化 结 构 域trans-activating domain；反式作用因子通过前者与 DNA特定序列结合,通过后者发挥转录活化功能；反式作用因子的作用机制：（1）转录因子相互作用、 （2）竞争性排除组蛋白、 （3）与核基质蛋白作用（空间网络状结构）、（4）DNA解旋作用；64. RNA剪接： 将 hnRNA核不均一 RNA）中的 内含子序列切除 ,外显子部分连接起来,名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 名师精编 优秀资料称为 RNA剪接
42、；65. 表观遗传学（ epigenetics）：表观遗传学是讨论不涉及DNA序列转变的基因表达和调控的可遗传修饰；66. 反义 RNA anti-sense：一段含有与被调控基因所产生mRNA互补碱基序列的小分子 RNA；67. RNAi：作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在 mRNA水平上诱导特异性序列基因缄默的 过程；由于 RNAi 发生在转录后水平,所以又称为转录后基因缄默（post-transcriptional gene silencing, PTGS ）mRNA的讨论方法Northern Blot：定性、半定量；RT-PCR：定性、定量原位杂交：定性、定位、半定量cDNA芯片：反义 RNA、RNA干扰、 MicroRNA、转录组蛋白质的讨论方法Western Blot：定性、半定量免疫组织化学：定性、定位、半定量抗体芯片：蛋白质组学：2D-PAGE/2 Dimensional-PAGE: 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（依据蛋白质 等电点进行分别 ）以及 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（依据 蛋白质的大小进行分别）；名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 12 页