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1、第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法。前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？【提示】血球计数板测出的是全部菌体数，而平板计数法只能测出活菌数，而且比实际数偏少。二、间接计数法的实验设计1制备土壤稀释液取土壤表层5
2、10 cm处的土样。准确称取1 g土样，放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中，振荡20 min后制成102倍的稀释液。然后进行系列稀释，得到103、104、105、106倍的系列稀释菌液。2取样及倒平板3培养4观察记录(1)计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30300个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10100个菌落为宜。(2)计算每克样品菌数公式：每克土壤样品菌数稀释倍数。一、微生物生长量的测定1.测重量法 干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤15次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100105 之间，再称重。以细菌为例，一个细胞一般重约10121013g，也可在较低温度(如
3、40 )下进行真空干燥。湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的20%25%。2计数法(1)直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都由400个小格组成。将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升
4、样品所含的细菌数。每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。(2)间接计数法(活菌计数法)稀释平板涂布法，常用来统计样品中的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时先将待测样品做一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿上，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。说明：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300个的平板进行计数。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制
5、备好的平板上，然后用无菌玻璃涂棒将菌液涂布在整个平板表面，放入适宜的温度下培养计算菌落数。为使结果接近真实值可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板中，经涂布、培养计算出菌落平均数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。每克样品中的菌落数(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。二、测定土壤中的微生
6、物数量土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的，这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用。因此，测定土壤的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。1实验原理平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例做一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平板上，培养一段时间后，每个单细胞生长繁殖形成单个菌落，根据稀释倍数、取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。2材料用具土壤样品：尿素，酵母粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，酚红，琼脂，1 mol/L NaOH溶液，无菌吸管，盛有9 mL无菌水的试管，盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，试管架，无菌培养皿，记
7、号笔，烧杯等。3方法步骤(1)制备尿素固体培养基准确称取尿素20 g，酵母粉0.1 g，磷酸二氢钾9.1 g，磷酸氢二钠9.5 g，酚红0.01 g，琼脂20 g，依次加入盛有900 mL 蒸馏水的烧杯中，加热溶解后，用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.27.4，补加蒸馏水至1 000 mL。(2)制备土壤样品稀释液称取土样10 g，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡约20 min，使土样和水充分混合，将土壤悬液制成101、102、103、104、105、106不同稀释度的稀释液。制备土壤样品稀释液时应注意每个吸管只能接触一个浓度的稀释液，且取样前需充分摇匀。(3)加样
8、取10套无菌培养皿，取104、105和106每种稀释度的稀释液做3个重复平板，留下一个平板作空白对照。分别用1 mL无菌移液管精确吸取104、105、106三个稀释度的菌悬液各0.2 mL，加至相应编号的无菌培养皿中(如图)。微生物数量测定的流程图(4)倒平板将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至45 左右的尿素培养基(倒入量约15 mL)，随即快速晃动培养皿，使菌液和培养基充分混匀后平置，待凝。(5)培养待平板完全凝固后，倒置于恒温箱中37 培养。(6)统计菌落数培养48 h后取出平板，统计各皿中的菌落数，将结果记录在表格中，计算结果时，应选取每皿菌落数在30300个(如图)的一组平板为代表
9、进行统计。每皿菌落数示意图(7)计算样品中菌数的公式每克样品的菌数同一稀释度的菌落平均数0.2稀释度10。直接计数法统计菌数在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由2516400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；把酵母菌培养液放置
10、在冰箱中；第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的3处错误：_。_。_。(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行_处理。(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是_。(4)如果观察到上图所示a、b、c、d、e 5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌_个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？_。解析对各小题逐项分析如下题号分析(1)在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔24 h就要统计一次菌落数目(2)为了避免杂菌污
11、染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理(3)(4)解答时要注意以下两点：统一单位；注意体积的变化。400个小室共容纳液体总体积为0.1 mm3，则80个小格容纳体积为：2102 mm3，含酵母菌48个，又因酵母菌的稀释度为102 mL，统一单位后即可求出酵母菌个数答案(1)应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据(2)灭菌(3)适当稀释(4)2.4108多次计数，求平均值某同学用一支移液管连续三次取1 mL菌液进行稀释(过程如图)，中间忘记冲洗移液管，计数结果将()A偏低B偏高C不变D无法判断B由于移液管
12、未冲洗，下一次使用时会带有上一次的高浓度菌液，使计数结果偏高。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。(3)现有一菌株
13、的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白质含_个氨基酸。审题导析解析(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30300个的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156178191)317
14、5个。每克土壤样品中的细菌数为1750.11051.75108(个)。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有27372个碱基，因此突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。答案(1)尿素酚红红(2)稀释涂布平板法1.75少(3)UGA115稀释平板计数法的误差分析(1)稀释时移液管不冲洗，偏大；(2)平板中菌落数太多，(可能重复)偏小；
15、(3)稀释时未混合均匀，可能大可能小。在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除含尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于()A空白对照B标准对照C相互对照D条件对照D本实验甲组为实验组，乙组为对照组，给实验组某种处理，给对照组另一条件的处理，为条件对照。1噬菌斑(如图1)是在长满细菌的培养基上，由一个噬菌体侵染细菌后不断裂解细菌产生的一个不长细菌的透明小圆区，它是检测噬菌体数量的重要方法之一。 现利用培养基培养并连续取样的方法， 得到噬菌体在感染大肠杆菌后数量的变化曲线(如图2)，对该曲线的叙述正
16、确的是()A曲线ab段噬菌体数量不变，说明噬菌体还没有开始侵染细菌B曲线ab段，细菌内正旺盛地进行细菌DNA的复制和有关蛋白质的合成C曲线bc段所对应的时间内噬菌体共繁殖了10代D限制cd段噬菌斑数量增加的因素最可能是绝大部分细菌已经被裂解D图中ab段噬菌斑已有一定数量，说明噬菌体已开始侵染细菌。bc段噬菌斑增加了10倍，说明噬菌体数约增加了10倍，而噬菌体繁殖10代，噬菌体数目应增加到210倍。cd段噬菌斑数目增加减缓，很可能是绝大多数宿主细菌细胞已被裂解。2菌种鉴定的重要依据是()A细菌的大小、形状和颜色B菌落的大小、形状、颜色C有无鞭毛D培养基的不同B不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为鉴定的重要依据。单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌种鉴定的依据。3请选出进行土壤中细菌计数的正确的操作步骤()土壤取样称取1 g土壤放入盛有99 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.5 mL进行平板涂布依次稀释至102、103、104、105、106倍稀释度ABCDC在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(1 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。