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1、 一、获奖者简介 二、理论依据 三、发展过程 四、具体实验1955年，Niels K. Jerne 便提出著名的免疫天择论，指出每个人体内都具有大量各式各样的抗体；当外来抗原进入人体时便会选择最适合的抗体来反应（也就是结合），而此一新结合的抗原抗体分子，又会刺激人体生产更多同类型的抗体。换言之，抗原在免疫反应里的作用彷佛模板，可供人体打造大量相对应的抗体。这个说法推翻了早先学界流行的想法，奠下现代免疫学的理论基础，同时也成为Burnet（Macfarlance，1960年诺贝尔生理医学奖得主）的选殖（clone）理论的前导。 1974年春天，二十八岁Georges Jean的刚从瑞士的巴塞尔免
2、疫学院得到博士学位，他选择了由Cesar Milstein负责的英国剑桥大学分子生物研究室，继续博士后研究。 Georges Jean的博士论文是研究抗体的基因突变，而Cesar Milstein则是一直从事抗体遗传学的研究，他与Cotto曾将大鼠（rat）与小鼠（mouse）的淋巴细胞融合在研究抗体的产生情形，他同时也探讨基因突变后抗体受到的影响。 1969年，Niels K. Jerne前往瑞士，担任巴塞尔免疫研究所所长。这段期间，它又把多年研究心得整理出两大理论，一是关于免疫细胞生成机制的诠释，另一个则是重要的网络理论（network theory），而后者正是让他获得诺贝尔奖的主因。这
3、两个重要的理论分别是在1971及1974年提出，从此改写免疫学理的基础。 1974年Cesar Milstein建议，Georges Jean针对P3抗体来筛选抗原。此时P3已培养成功，如能找到抗原将是研究抗体遗传学最好的实验工具了。但这是一件费时费力且十分单调的工作。 Cesar Milstein和Georges Jean的研究，正是利用这个警报系统来抗癌。他们培养出所谓的融合瘤（hybridoma），也就是让癌细胞与制造抗体的细胞相融合。由于癌细胞在人工培养环境中可以不断生长，所以融合瘤也可以长生不老。于是，科学家可以藉由变换细胞的种类，来制造想要的抗体，而且是不限量制造。又因为免疫系统具
4、有内建的基因置换机制（gene-shuffling mechanism），能够变换组合出好几百万种抗体，每一种抗体都是专为识别、捕捉某特定蛋白质而量身订做的。因此，科学家可以针对会刺激血管朝肿瘤生长的因子，设计出相对的抑制剂做为药物。 本实验关键步骤是细胞的融合，具体步骤如下：1) 小白鼠 (BALB/c) 先以 目标抗原 (如菌体) 免疫，2) 抗原需加 佐剂 (adjuvant, 如 TiterMax) 制成乳剂，3) 打入小鼠体内 慢慢释出 (免疫流程)，4) 诱使 B 细胞成熟增殖并生产抗体，5) 然后取出脾细胞 (大多为 B 细胞) 与6) 骨髓癌细胞进行细胞融合。2?) 注意乳剂的
5、生产要完全，可取小量滴入水中，震动后应该不会散去。 也可以在 电泳后，切出所要色带，胶体装入乳化针筒，加入佐剂 直接制成乳剂，可有相当好的免疫效果。3 ) 有人直接取出健康的脾细胞，在培养中加入抗原进行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 近来更流行以抗原的 DNA 种入肝脏中，以此 DNA 的表现产物，直接在生物体内诱发免疫反应。 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应还是最可靠。 小白鼠脾脏细胞 B 与 NS-1 细胞 N 以 PEG 进行融合，操作在 10 min 内完成，随即把细胞平均分配在 96 槽细胞培养盘中。 由于
6、融合是随机的，故可能的组合有：B-N, B-B, N-N, B-B-B, B-B-N.；只有同时含有 B 与 N 的融合细胞才会活下去1) NS-1 要健康，在 T-80 培养瓶内生长密度不要超过六成，一瓶 T-80 细胞用在一次融合。脾细胞取出后可以不用除去红血球，直接以 RPMI 洗三次，要小心自行调整 离心力 不致太大，也不能太小，随时镜检之。 2) 要用可靠的 PEG 1500，可使用商品已配置好的溶液，每次 0.71 mL；否则自己要试出可用的批次，在高压灭菌时，尽量缩短灭菌时间 (5 min 足够)，并且要尽速由灭菌釜内取出。 3) 把 NS-1 与脾细胞混合，每次使用一个 T-8
7、0 与一个脾脏，几乎可以不用数细胞数目；在 50 mL 离心管中，小心把细胞离心下来，倒去上清后，以残留的 RPMI 把细胞打散，放在 37内保温准备加入 PEG。 4) 在 2 min 内慢慢加入 PEG，同时一边轻轻摇动，让 PEG 均匀地混合细胞。然后在 2 min 内加入 2 mL RPMI，边加边混匀；再于 2 min 内，再加 8 mL RPMI。此时镜检可看到许多细胞聚合，如上图的黑白照片；若在融合后 1 h 内看不到很多融合细胞，可能已经失败。 5) 离心去掉上清，轻轻加入 30 mL HAT-RPMI，并均匀悬浊细胞。此步骤最为关键，离心力不可过大，以免把融合后的脆弱细胞压成
8、一块；若你无法轻易而均匀地把细胞悬浊，可能已经失败。 6) 把细胞放在保温箱 30 min 后，均分到三片 96 孔培养盘，每槽加约三至四滴，分配要平均。 7) 从第二天起就不再用 HAT，改用 HT-RPMI 即可。添加或换培养液时，不要扰动细胞，并且不要在培养相外面放置太久。 第二或第三天镜检可以看到很多二元体，是融合后的第一次分裂；这种二元体数目应该很多，培养槽内到处都会冒出来 (约 25 至 50 对)，可以用雨后春笋来形容之，否则可能已经失败。 8) 但细胞仍然迅速死亡，最后每槽只剩下一或二个稳定细胞群落，约一周内可以看到如下面彩色图片所示的细胞堆，此时可以进行 ELISA 筛选。
9、) 初步筛选： 融合后马上以 HAT 培养，能活下来的都是上述 B 细胞与 NS-1 的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未十分稳定。 2)筛选专一性抗体： 并非所有 B 细胞都会产生我们所要的抗体，小白鼠原先就存在许多 B 细胞株对抗一般疾病；因此要用 酶免疫分析法 (ELISA) 挑出专一性抗体 。 3)单株化： 这样所挑出来的细胞株，也许仍含有两群以上的细胞 (为什么？)，因此要进行单株化；先将该细胞株稀释，重新平分到 96 槽细胞培养盘中，以计算使得每槽中只含有一个细胞，俟其生长成群落后，再次以 ELISA 筛选专一性抗体。1) 可把挑选出来的融合细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后收集
10、所产生的 腹水，腹水中的抗体浓度非常高，每 mL 可达数 mg。 2) 把融合细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 3) 所得到的抗体再经纯化步骤，以除去杂质，可用下列各种方法的组合1.硫酸铵分划： 收集约 40% 饱和度的沉淀，是最经济、方便的方法。2.离子交换法： 用 DEAE 阴离子交换法，多用在纯化 IgG。3.胶体过滤法： 以分子量的差异分划出各种抗体，多用在纯化 IgM。4.亲和层析法： 以 Protein A-吸着剂 专一性地吸住抗体分子 (IgG)。21 结束语结束语