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1、RT-PCR 原理与实验操作步骤关键词： RT-PCR 逆转录酶reversetranscriptase 聚合酶链式反应引物设计DNA 聚合酶一、知识背景 ：1、基因表达： DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104 个丝心蛋白mRNA（每个 mRNA 存活 4d，可以合成 105 个丝心蛋白）共合成 109 个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR 技术 (olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应
2、，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA ；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2 存在下，退火引物沿5 3 方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（ reverse transcriptase）是存在于RNA 病毒体内的依赖RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以RNA 为模板合成cDNA 第一条链；2、Rnase 水解活性：水解RNANA 杂合体中的RNA ；
3、3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条DNA 链为模板合成互补的双链cDNA. 二、 RT-PCR 的准备 ：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理
4、 - - - - - - - 第 1 页，共 9 页 - - - - - - - - - 2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度 :一般为 1530bp ，引物太短会影响PCR 的特异性，引物太长PCR 的最适延伸温度会超过Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布： 四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3 个以上的单一碱基。 GC 含量（ Tm 值）： 40 60， PCR 扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去 510 度。c、 3端要求： 3端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的
5、引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的3端最好选用A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4 个连续碱基互补，3端不应超过2 个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8 个的互补碱基存在。g、5端无严格限制： 5末端碱基可以游离，但最好是G 或 C，使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0 ， Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设
6、置。2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过0.1%DEPC 水浸泡处理，除去 RNA 酶，防止操作过程中RNA 降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC ）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75% 酒精、经DEPC 处理并高压的水。三、 RNA 的提取方法：RTPCR 中从细胞分离的RNA 的质量至关重要，包括RNA 的纯度和完整性。 RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包
7、括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性， 主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC ）去除外源性RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。实验操作步骤一、实验器具与材料：1、移液枪： 1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头： 1ml、200l、20l名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 9 页 - - - - - - - - - 3、匀浆管： 5ml 4、吸头台：放置1ml 吸头的
8、一个，放置20l 吸头的一个5、EP 管： 1.5ml 、0.2ml 、100l6、试剂瓶： 2 个 60ml 的棕色试剂瓶（广口，带盖）1 个 125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒： 50ml 、250ml 、500ml 8、容量瓶： 250ml 、500ml 、1000ml 9、试管架： 5ml、1.5ml 、20l10、盐水瓶： 250ml 、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC 水11、铝制饭盒： 4 个12、塑料小饭盒： 1 个13、大瓷缸： 2 个14、锡泊纸：一卷15、卷纸： 2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：
9、（包括枪头、EP 管、匀浆管等）先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC 水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP 管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC 水泡）（洗净后先泡1DEPC 过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC ）三、试剂配制：1、DEPC 水：吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成1DEPC 水，放在 1000ml 容量瓶中静置4 小时备用。2、75% 乙醇：用无水乙醇DEPC 水配，然后放 -20保存（其中DEPC 水
10、需先高压）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 9 页 - - - - - - - - - 3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？ pH8.0 蒸溜水1000ml 5 TBE （贮存液）再将 5 TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml 贮存液450ml 水-500ml 工作缓冲液2、上样缓冲液
11、：0.25% 溴酚蓝0.25% 二甲苯青 FF 30% 甘油6 缓冲液， 4保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0% ：1.0g 琼脂糖100ml 电泳缓冲液，微波炉中火30 秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml 溴化乙锭 2.5l，充分混匀， 将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min 后现进行电泳。2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为1.5g 六、需购置的RT-PCR 材料：（生工 . Tel. 2236106. ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - -
12、 - - - - 第 4 页，共 9 页 - - - - - - - - - Taq 酶（含 MgCl2 Buffer ） 200u 70.00 dNTP: 1 支Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1 支 110 - -20 DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies - 4Marker: 10g 0.2 g/ml 150.00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）七、引物合
13、成正义： 5 -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3反义： 5 -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-32、par-4: 正义： 5 -GGGACCTCGGAACTCAAC-3反义： 5 -TGTATCTGCCTGGGACTG-33、退火温度计算2（A T） 4（G C ）正反义平均数，再上下波动度（ 4，或 5）4、引物各合成5 OD ，每 OD 一瓶分装好5、引物稀释：加 DEPC 水量为（ l）= ? nmol / OD 管上所标 OD 数 100 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - -
14、- 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 9 页 - - - - - - - - - 是为 10p mol / l 浓度的引物溶液八、 PCR 产物电泳先将 1-10l 左右 PCR 产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA ，电源 100V ，电泳 30 分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt 时，先打开 PCR 预热 30 分钟。3、RNA 抽提前，打开离心机预冷。TRIzol 法抽提总 RNA 细胞 1 107 组织 100mg 加 1mlTRIzol 细胞用 1ml 加样器吹至
15、液体澄清且无细胞团块匀浆（要彻底，后转至EP 管）（组织匀浆量 100mg 时分装 1ml/ 每 EP 管）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟加氯仿 1/5 体积（ 0.2ml ）（必须按总体积的1/5）颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟4，离心 12000g ，15 分钟名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 9 页 - - - - - - - - - 转上层水相（约400l ）于另一 1.5mlEP 管中加等体积异丙醇（约400l ），混匀室温10 分钟4，离
16、心 12000g ，10 分钟弃上清加冰预冷的 75% 乙醇（用 DEPC 水配） 1ml 4离心 7500g ，5 分钟弃上清，空气干燥5-10 分钟（不能完全干燥）溶于 DEPC 水中至 20l（10l-20l）（可在 55-60 水中， 10 分钟助溶）注：1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC 溶解2、细胞组织加TRIzol 匀浆后，可在 -60放置至少一个月（甚至可一年以上）3、RNA 在 75% 乙醇中， 2-8 至少可保存一周，-20至少可保存一年两步法 RT-PCR （第一步：逆转录反应）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - -
17、 - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 9 页 - - - - - - - - - 试剂 浓度 体积终浓度RNA 23l(11.5l)Oligo(dT)15 0.05g/ l 4 l(2 l) 0.005g/ l（稀释 10 倍后用）混匀，离心， 70 5min 立即冰水浴，稍离心试剂 浓度 体积终浓度M-MLV Buffer 5 8 l (4l) 1dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mMRNasin 40U/ l 1 l (0.5l) 20M-MLV 200U/l 2 l (1l) 200U总体积 40l（20l）混匀，
18、离心， 42 60min 95 10min （破坏 MLV）4保存两步法 RT-PCR （第二步： PCR 反应）总体积 20l(50 l)名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 9 页 - - - - - - - - - 试剂 浓度 体积终浓度Taq Buffer 10 2 l (5l_) 1MgCl2 25mM 1.2 l (3l) 1.5mMdNTP 10mM 0.2l (0.5l) 200uM上游引物10pmol/l 0.3 l (1 l) 10pmol下游引物10pmol/l 0.3 l (1 l) 10pmolcDNA 模板X (?) (1- 10l)DEPC 水 20l-4.3 l-X 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 9 页 - - - - - - - - -