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-/ 植物细胞工程复习 第二章 名词解释 植物细胞工程：植物体的细胞中，含有该植物所有的遗传信息。在合适的条件下，一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种全能性，生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒，以及通过对细胞核物质的重新组合，进行植物遗传改造等。这就是人们常说的植物细胞工程。 细胞全能性(totipotency）：植物细胞具有该植物有机体的全部遗传信息，并具有形成植物有机体所有细胞类型，直至发育成完整植株的能力。 脱分化（dedifferentiation）：在离体培养的条件下，已分化的细胞，失去原有的形态和机能，从而形成没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织的过程。 再分化（redifferentiation）： 由脱分化状态的细胞再度分化形成一种或几种类型细胞的过程。包括细胞分化、组织分化和器官分化等。再分化通过胚胎发生途径或器官发生途径实现。 外植体(explant) ：指切离植物体后用以离体培养的各种接种材料，包括胚胎材料、各种器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织（Callus）：在人工诱导或自然条件下，植物细胞脱分化，不断增殖产生的主要有薄壁细胞构成的不定形的组织。 思考题 1、影响脱分化有关的因子及其作用 （１）创伤刺激 （除种子外）离体培养均产生创伤，创伤反应与组织培养时脱分化和再分化的时间基本一致，创伤影响细胞分裂和分化作用，创伤是引起细胞脱分化的第一个因子。 （2）生长物质的影响 培养基中添加外源植物生长物质对细胞的脱分化起着决定性的作用 。２，４－Ｄ等生长物质，能使细胞脱分化并分裂；生长素＋细胞分裂素 （3）培养细胞的异质性 异质性细胞对培养条件刺激有不同敏感度。异质性细胞：不同染色体倍数。如豌豆2x、3x和4x细胞的外植体（根）培养在含2，4—D培养基中，只二倍体细胞脱分化分裂。培养在2，4—D+酵母汁培养基中， 2x、3x和4x细胞均脱分化，一周后4x的脱分化占优势。 异质性细胞：不同生理状态 菊苣块茎储存时间　　脱分化所需时间　　　　　　　 　　５个月　　　　　 ２０－２４小时 　　１２个月　　　　　　６０小时　 发现脱分化所需时间的长短与细胞内RNA变化有关。贮藏7个月，外植体中的RNA含量从8ug→5ug直线下降。 4）光线的影响 光下切菊苣外植体→暗培养→ 35～40％周缘细胞进入第一次细胞分裂。 绿光（低强度）取外植体→暗培养→ 60％～75％的细胞进入第一次分裂。暗培养最初9～l0小时内(DNA开始复制之前)，光照10～15秒，分裂细胞的百分率减少一半。 外植体在DNA复制开始后，对光线就不敏感。 2、愈伤组织的特点、类型，及走愈伤组织的优缺点： （1） 细胞大而不规则、生长旺盛、高度液泡化、 异质性（形状大小各异）、无明显极性，没有次生 壁和胞间联丝的薄壁细胞和许多小的分生细胞群。 （2） 愈伤组织按其形态结构可分为 致密愈伤：细胞小而致密，质地坚实，生长较慢 松散愈伤：细胞较大，结构较松散，浅色，质地松散，生长迅速 （3） 诱导培养愈伤组织途径的优缺点 优 点 a、为细胞培养提供单细胞或小细胞团 b、似乎是大规模繁殖无菌苗的途径之一 C、是植物脱毒培养的一条有效途径 D、继代培养中可能建立良好的变异系 缺 点 A、继代次数增加，染色体倍性变化，愈伤分化再生苗能力渐衰减至丧失。 B、愈伤组织长期培养细胞常发生变异，分化再生苗不同于亲本，丧失应有价值。无性系快繁工厂化育苗一般不采用此途径。 3、 外植体经哪些途径可再分化为完整植株。 4、 影响体细胞胚形成的因素及调控。（影响体细胞胚发生和发育的因素） 1）生长物质：主要是生长素 2,4-D→58%双子叶植物，100%单子叶植物体细胞胚发生的诱导阶段。双子叶用量是单子叶植物的1/10~1/20，诱导脱分化后需及时降低或去掉2,4-D，胚性细胞才能正常发育。 如:双子叶植物枸杞： MS+0.2mg/L2,4-D → callus → 继代4-5次→胚性callus → MS →体细胞胚 2）氮源： NH4+-N（还原态氮）有利体细胞胚发生。 如野生胡萝卜培养基中只含55mMKNO3，无体细胞胚发生，加入5mMNH4Cl，体细胞胚形成。 有机氮促进体细胞胚形成。 水解酪蛋白（500-1000mg/L）、酵母提取物（500-1000mg/L）、氨基酸等，均还原态氮。 3）其他因子 K+：20mM是野生胡萝卜胚胎发生所必需的。 溶氧：低于一个临界值（1.5mg/L）。 活性碳：能提高胡萝卜体胚发生的频率。 糖：诱导体细胞胚发生不可缺的组成分。 （4） 外植体供体植物的基因型，外植体的来源和生理状况（发育阶段），双子叶植物用下胚轴、子叶和胚等，单子叶植物用茎尖、叶基部和胚等 第三章 名词解释 植物组织培养（tissue culture） 指在含有营养物质和植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。 基本培养基：大量元素、微量元素、维生素和氨基酸，碳源和水。常见MS、White、Nitsch、B5和N6等。 完全培养基：根据不同试验要求，在基本培养基中附加一些物质，如各种植物生长物质以及其它有机附加物（如椰乳、香蕉汁、番 茄汁、酵母提取物、麦芽等）。 植物脱毒培养： 脱病毒方法： 1、物理方法: Ｘ射线、紫外线和高温处理等→病毒钝化。 常用热处理法。 方式：热水处理（约50 ℃ ）适用于休眠组织； 热空气处理（35-40℃）对活跃生长茎尖等。 2 、 化学方法:农药，少用 3 、 生物学方法： 无病毒种子繁殖：较长的童期，且不能保持亲本 优良性状； 嫁接：<0.5mm茎尖才无病毒，组织小成活率低； 茎尖分生组织培养：最有效。 人工种子（artificial seeds） 植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、枝尖等）包裹在含有营养物质和具有保护功能的外壳形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。 人工种子组成：胚性组织、人工胚乳、人工种皮 思考题 1、 什么是植物快繁技术（微型繁殖）？总结其主要操作步骤。 无性快繁技术：应用植物组织培养方法，以无性系为材料大量快速繁殖植物的技术。 微型繁殖一般涉及４个步骤： 无菌培养物的建立； 茎芽的增殖； 根的诱导； 试管苗的移栽 2、工厂化育苗中，要考虑那些因素？ 试管育苗需估计的 参数： 市场因素： 技术因素：1）增殖率：经1次继代培养获得增殖 体与原转移增殖体的个数比值。 （2）代期：每次继代培养所用的时间。 （3）代次高限：如香蕉不超过８代等。 （4）变异率：试管苗变异率较常规繁殖高。 （5）培养基配方：降低生产成本。如液培代 固培；化学纯代分析纯；食用糖代蔗 糖；自来水代蒸馏水等。 （6）环境条件的优化控制：调光、温等。 组织培养的实验程序和技术要点 一、无菌培养物的建立 二、茎芽的增殖 三、根的诱导培养 四、试管苗的移栽 3、茎芽的增殖方式 1、通过愈伤组织诱导不定芽的形成 不定芽（adventitious buds ）指从非正常（叶腋和茎尖）出芽的位置上诱导而形成的芽，如从根、叶和愈伤组织 中诱导的芽 。不足：遗传上不稳定性，苗为二倍体、多倍体和非整倍体等；愈伤组织再生能力随着时间推移而下降。 2、直接从外植体诱导不定芽的产生 优点：诱导的不定芽形成一致的二倍体。 缺点：具遗传嵌合性的品种，在不定芽形成时 招致嵌合体裂解，出现纯型植株情况。 如花斑叶天竺葵某个嵌合体品种，由叶 柄节段直接形成的不定芽长成植株后， 叶片或绿色或白色，无绿色与白色嵌合体。 3、增强腋芽生枝能力 腋芽去顶→代顶芽发育成主干→过程多次重复→外植体成一丛新枝→新枝→相同培养基→重复枝条增殖。 把枝条培养在含CTK、GA和生长素等的培养基，可增强枝条腋芽生枝能力。 优点：开始速度慢，一时期后，枝条数目以对数增加； 茎尖培养，不发生基因型的变化。 4、配制培养基： 100ml大量元素 + 10ml微量元素 + 10ml铁盐 + 10ml有机物 + 生长物质 + 30g蔗糖 + 7g琼脂， 煮沸溶解, 调pH，定容1L，灭菌备用。 灭菌后的培养基一般隔天再用，pH偏酸0.1-0.3 。 培养基在低温暗中可保存一段时间（<1个月）。 1、母液的配制和保存： 培养基母液指按培养基配方配制浓度高 １０－１００倍的高浓度溶液。 大量元素 １０倍 微量元素 １００倍 Fe盐（FeSO4-7H2O；Na2-EDTA） １００倍 有机物 １００倍 植物生长物质 0.1～1.0mg/L 5、茎尖脱毒培养的原理： 根据病毒在植物体输导组织传播，造成分布不均一性。老叶及成熟的组织或器官中病毒含量较高，幼嫩及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，生长点（0.1-1mm区域）由于输导组织尚未形成，几乎不含病毒 6、抽滤灭菌法 对象：高温高压易被破坏的成分（GA、IAA、 ZT、ABA、尿素和某些维生素等） 或液体培养基。 操作：滤膜（孔径0.45微米） 、过滤器和 抽滤瓶等高压灭菌，无菌条件下 溶液经滤膜流入抽滤瓶中或已冷却（＜ 40℃）的培养基中。 7、如何调整培养基配方以促进根和芽的分化？ 一般增殖芽长到１－２厘米时， 转入生根培养基培养。 筛选生根培养基配方的原则： 发根快、多而粗壮，茎基部不形成愈伤组织。 生根培养基：去除CTK，降生长素浓度， 甚至在无激素；1/2或1/4MS。 第四章 悬浮培养（suspension culture）在愈伤组织液体培养的基础上发展起来。指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 成批培养（Batch culture）： 细胞接种到一个与外界隔绝的只允许气体和挥发性的代谢物质交换的、营养液体积保持不变的密闭系统中培养。 培养基营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长停止。取小部分的悬浮培养液，转入相同新鲜培养基中继代培养（约稀释了５倍）。 连续培养（Continuous culture）：在一定容积但非密闭的反应器中进行，培养过程中不断注入新鲜培养基，营养物质连续得到补充，细胞的生长和增殖连续进行。 固相化细胞培养：细胞固定在一种惰性基质上（如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺和纤维等膜），细胞不能运动，营养液在胞间流动，供应细胞营养的培养方法。 单细胞培养（Single cell culture），也称单细胞克隆技术。指单离细胞在一定培养条件下进行增殖、分化并形成完整植株的过程。 植板率（％）＝（细胞团数/接种细胞数）100％ 1、 细胞悬浮培养的类型及培养过程中应注意的事项？ 悬浮培养类型：成批培养、连续培养（封闭式连续培养、开放式连续培养、恒化培养、恒浊培养） 成批培养注意事项： （1）培养期间培养罐内的压力应保持在0.5 kg/cm2。 （2）指数生长期内，应追加消泡剂（如丙烯乙二醇等）。 连续培养注意： （1）防pH变动，加固态磷酸缓冲剂，如磷酸钙、EDTA等。 （2）培养过程中加入消泡剂。 （3）加入抗菌剂防反应器污染，如泰乐菌素和制菌素等。 2、单细胞培养的技术方法有哪些？ 1、平板培养（plating culture）：琼脂+液体培养基→熔化→冷却约35℃→与等体积的细胞悬浮培养液混合→倒培养皿→凝固薄层（约1mm）→封口膜→培养→单个细胞或由几个细胞组成的细胞团生长、分裂，形成起源于单细胞的小群落→编号→分离小群落→进一步扩大繁殖→形成起源单细胞的无性系。 不加琼脂即液体浅层培养。 2、看护培养（nurse culture） ： 3、微室培养（micro-chamber culture） ： 无菌下，含培养液的细胞培养在微室，显微镜下连续观察细胞的生长、分裂和小细胞团形成的全过程。 4、 条件培养（conditional culture） ：加入条件培养液（经一定时间细胞悬浮培养的培养液）。 5、 饲喂层技术（feeder layer technique） ：核失活的植物活细胞制一薄层，单细胞以液体浅层或平板培养在薄层上。 3、 细胞大量培养生产有用物质的技术因素有哪些？ 1、高产目的物细胞系的选择 （1） 以特异器官为外植体，建立高产细胞系。 （2）化学诱变或紫外线照射等筛选高产细胞系。 （3）利用克隆技术筛选出高产色素、维生素、生物碱和甾类等化合物的细胞系。 2、二步培养法 第一步：解决生物产量，即增加细胞量。 第二步：解决次生物质生产问题， 即促进次生物质的合成。 紫草宁生产：先LS培养基中促细胞的生长；后转White培养基促紫草宁生产。紫草宁衍生物产量比仅在White培养基上翻一番，仅在LS培养基上几乎测不出紫草宁衍生物。 3、在培养基中适时加入次生代谢物的前体 如培养一周的曼陀罗愈伤组织振荡培养液中，添加0.2%苯丙氨酸，生物碱产量比对照高3倍；但培养三周后添加0.2%苯丙氨酸，导致生物碱产量减少。 红豆杉细胞培养中，在培养第15天向培养基中同时加入果糖和前体物质，获得较高产量的紫杉醇。 4、培养基中植物生长物质的作用： 常用2,4-D、IAA、IBA、NAA和细胞分离素。 如烟草愈伤组织培养中，含IAA的培养基上能合成烟碱；毛地黄愈伤组织培养基中含IAA，合成毛地黄蒽醌能力高；培养三分三愈伤组织时，在生长后期添加1mg/LKT,使东莨菪碱的含量高于植物体中。 是次生代谢产物的启动因子。 5、培养条件的影响： 光强： 如烟草细胞培养物中黄酮类的合成需光；芸香愈伤组织在光和暗中精油的成分不同。 光质 ：红光提高胡萝卜愈伤组织中叶绿素及胡萝卜素的含量；蓝光抑制八仙花细胞培养物中多酚化合物的合成。 温度 ：如胡萝卜愈伤组织低温处理能形成花青素；植物细胞培养物的脂肪酸的积累在15℃下积累最多 第五章 原生质体融合（protoplast fusion）或体细胞杂交（somatic hybridization）不同亲本的原生质体间在人工条件下互相融为一体，通过离体培养，使其再生杂种植株的技术。自发融合和诱导融合。 自发融合（spontaneous fusion）在酶解细胞壁过程中，胞间连丝的扩展和黏连，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体(homokaryon)，每个同核体包含2－40个核。 诱发融合(induced fusion)质膜表面负电性，原生质体间互相排斥，一定诱导方法，促原生质体的融合。不同来源的原生质体融合形成的杂种原生质体称异核体（heterokaryon） 1、 影响植物原生质体的制备的因素有哪些? A、原生质体制备的原始材料 叶片：最方便最普遍的来源，分离到较均匀一致的原生质体。 B、酶混合液 ① 纤维素酶（Cellulase）：Onozuka R-10， Onozuka R-S，EA3-867。消化细胞壁的纤维素。 ②半纤维素酶（Hemicelluase）：Rhozyme HP-150。消化细胞壁的半纤维素。 ③果胶酶（Pectinase）：Pectalyase Y-23。溶解细胞间由果胶质组成的胞间层。 ④崩溃酶（Driselase）：含纤维素酶、果胶酶、 蛋白酶和核酸酶等。 ⑤蜗牛酶：含多种解离酶，分解孢粉素和木质素，用花粉母细胞和四分体的小孢子等。 配置酶制剂原则： 最少品种和最少量，但能分离得到健康的原生质体。纤维素酶和果胶酶为必需酶。 一般叶片用纤维素酶和果胶酶；愈伤组织或根再添加半纤维素酶 2、渗透压稳定剂 离体原生质体基本属性：渗透破碎性。在酶溶液、原生质体清洗介质和原生质体培养 基中加入适当的渗透压稳定剂。 在合适渗透压溶液中，原生质体呈球形。 渗透压稳定剂： ——甘露醇、山梨醇、葡萄糖等。 目的：（1）使细胞产生轻度质壁分离； （2）保持原生质体的完整性； （3）原生质体生命活动的碳源 叶片用前两者；悬浮细胞用葡萄糖。浓度450-800 mmol/L 3、原生质膜稳定剂 ——无机盐类或其它化合物 如：CaCl2、 KH2PO4、葡聚糖硫酸钾等。 目的：降低酶制剂中的RNA酶活性、防止质膜 被破坏、提高原生质体的活力。 C、酶混合液：1、酶制剂 2、渗透压稳定剂 3、原生质膜稳定剂 pH值一般为 5.4～6.0 贮存于冰箱，使用时化冻即可，可保存数月。 2、融合的杂种细胞如何选择? （1） 双荧光标记法 荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）和异硫氰酸罗丹明（RTTC，红光）分别标记两种来源的原生质体。荧光显微镜，选择杂种细胞。 （2） 互补选择法：在遗传上、生理上和抗性上互补等的方法。 白化（aB）+白化（Ab）→绿(AaBb) 营养缺陷(aB)+营养缺陷(Ab) →自养(AaBb) 3、体细胞杂种的鉴定 （1）形态学观察： 株高、叶形、花形和花色等。杂种植株具有双亲形态特征，或双亲的中间类型，或与亲本有区别。种间趋双亲间； 属间则偏向某一方。 （2）细胞学观察： 应用染色体计数法、核型分析和显带技术鉴定观察染色体数目、大小与形态变化。 （3）生化鉴定： 同功酶谱分析法：酯酶、过氧化物酶和6-磷酸 葡萄糖脱氢酶等。体细胞杂 种常表现双亲酶谱的特征。 4、体细胞融合的意义是什么? （1）合成新的物种， 多种利用价值的新经济植物。 （2）培育抗病新种质，一种植物抗性（抗病、抗寒等）转入另一植物，研究最多是马铃薯。马铃薯野生种抗多种病毒。 （3）低光合作用效率的植物转变成高光效植物。 如： C3C4。 （4） 将豆科植物的共生结瘤固氮能力转入非豆科植物。 （5） 得到高含量次生代谢产物（生物碱等）的植物。 第六章 单倍体育种 以单倍体为材料的育种程序，含花粉培养、花药培养、未受精子房培养和胚珠培养等。 花药培养（anther culture） ：对花粉发育到一定阶段的花药进行培养，改变花药内花粉粒的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，后由胚状体直接发育为植 株，或使愈伤组织分化成植株的过程。 花粉培养（Pollen culture） ：从花药游离出花粉粒通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的过程。 幼胚(immature embryo)培养 指发育未成熟的胚培养，要求较好的培养条件和较复杂的操作技术（胚剥离），越早期的胚，培养越困难。 1、通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？ 以单倍体为材料的育种程序，含花粉培养、花药培养、未受精子房培养和胚珠培养等 2、 花药培养中如何选择外植体？ （1）供试材料的遗传背景： 不同种、不同品种间花药，离体培养反应能力有明显差异。如马铃薯tuberosum种的80多个品种花药培养中，只12个品种被启动，其中只2个品种得到单倍体植株。 花药中小孢子产生植株的能力被称为花药培养力。已证明花药培养力与一些基因的表达有关。 （2）供试材料的生理状态： A、多年生植物中幼年比老年好。 B、草本植物生长健壮和生殖生长高峰期的 花药诱导频率高。如烟草开花早期花药 易产生花粉植株，约在始花期6天时花药的 花粉胚诱导频率最高。 C、一定程度的逆境下有利于花药萌发。 如高纬度和高海拔的小麦花药培养成功率 较高。逆境有利于花药中的小孢子在培 养条件下表达细胞全能性。 （3）花粉的发育时期： 诱导花粉胚或花粉愈伤组织适宜的培养时期为单核中晚期（即单核靠边期）到双核早期。 3、花药培养与花粉培养有什么不同？ 4、花药培养过程中花药为何要经过低温处理？ （1）低温预处理明显提高花粉胚的诱导频率。 低温作用：保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。 5、 花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度的激素？ 高浓度2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，增加二倍体细胞发育的机会。 花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制花药壁等二倍体细胞的分裂。 6、 花药培养中再生植株的形成途径与再生植株倍性有何关系？ ①胚状体途径；②愈伤组织途径。 7、幼胚培养的关键技术是什么？ A、取材时期：球形胚至鱼雷胚时期。 B、幼胚剥离：一个胚为一个植株，剥离成功与否是幼胚培养能否成功的关键。借助解剖镜，剥离过程要保湿（幼胚半透明、高黏稠状组织，易失水），操作快速。 C、接种培养：立即接种培养基中培养。 8、 植物胚培养的意义? ①克服杂交育种中杂种胚的早期夭折 远缘杂交常发生杂种不育现象：胚发育不良；胚乳发育不良；有时胚和胚乳间的障碍物质阻碍了营养物质的运输等。 ②克服珠心胚干扰，提高育种效率 自然界中有些植物种子存在多胚现象如柑橘、芒果等。受精只产生的一个有性胚，珠心细胞发育成多胚。珠心胚干扰杂种胚的确定，珠心胚造成杂种胚夭折。通过幼胚培养可克服。 ③理论研究领域的应用，如研究胚发育中胚乳的作用等。 9、幼胚培养条件 培养基：幼胚处于异养状态，培养基不仅要完全的 营养成分，对培养基渗透压（4 -12％蔗糖）。因原胚“浸没”在高渗透压的胚乳液中，若处低渗中，幼胚生长停顿或死亡。胚小→大，渗透压高→ 低。 激素水平：为控制胚性生长，促进胚发育成熟，要求生长素和细胞分裂素配合使用。低浓度GA和KT能促进幼胚早熟萌发， GA有时具有胚柄作用，GA是必需的，一般为0.5mg/L。 附加物：幼胚培养多处于异养阶段，需胚乳和周围的母体组织提供营养。常用复杂的天然植物提取物（胚乳提取物必不可少，椰乳、玉米胚乳和麦芽提取物等 ） ，它既含多种植物生长调节剂，又提供胚发育所需的丰富的营养物质。 活性炭：通常加入培养基，吸收胚培养中释放的有毒物或过量抑制胚生长的物质，使胚顺利发育成熟、成苗。 光照：培养初期黑暗条件是必需的。黑暗时间与胚 发育时期有关，早期胚暗期长。如球型胚至心 形胚暗培养2周后光照。芥菜实验，早期光照 不利胚根的发育，但胚芽发育需一定的光照。 温度：与该植物种子萌发温度一致。 第七章 遗传转化：是指同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。 直接转化：将裸露的DNA直接导入植物细胞的转化方法。 裸露的DNA可以是全部或部分染色体，分离的DNA，也可以是基因工程质粒。 介导转化：介导转化是利用另一种生物来实现基因的转入和整合。 1．哪些因素会影响培养物的遗传变异？ （1）植物种类，或称遗传背景； （2） 材料来源，组织或器官； （3）继代培养次数，次数增多则变异率增高。 （如香蕉继代30代，染色体数量变异率 1.3%，60代8.5%。） 1、培养条件引起新的异常： （1）培养基成分对染色体倍性变异的影响： 如plopapus gracilis 培养物4、6、16条染色体的3个体细胞系，2，4－D的Ｂ５培养基，16条染色体的体细胞系逐步丢失染色体形成稳定的 13 条染色体。 （2）培养基成分引起不同倍性细胞的选择分裂： 如豌豆根： 2，4-D培养基→二倍体细胞分裂； 2 ，4-D + KT + 酵母提取液培养基 → 四倍体细胞分裂。 3）培养基物理状态的影响： 悬浮培养→二倍体；半固化培养→四倍体。 2、 诱变剂 （1）物理诱变剂： Ｘ射线、α射线、β射线、r射线和紫外线等。 （2） 化学诱变剂： 甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ），乙烯亚胺（ＥＬ）， ５－溴尿嘧啶（ＢＵＤＲ），吖啶橙。 ３、 诱变剂的剂量 不同来源的细胞对诱变剂的敏感程度有差异。 （1）细胞快速增殖时诱变处理，产生突变率最高； （2）游离的原生质体对诱变剂的敏感性高于愈伤组 织细胞，但比叶肉细胞小； （3）化学诱变剂对原生质体的毒性比物理因素大； （4）单倍体细胞比二倍体细胞更敏感等。 最适剂量：以半致死量多一些为宜。 2． 体细胞无性系变异的诱导和选择方法。 1、直接选择法：选择条件下，新的突变表现型优先生长，或可测定的其他可见的差异。分正选择法和负选择法 。 (1)正选择法：细胞置于含特定物质培养基上，如有毒 （如抗代谢物）或有害（如低温）培养基上，野生型（正常）细胞不生长，突变体能生长。 （2） 负选择法：选择培养基，正常生长细胞因吸收培养基中外加选择剂而死亡，突变体不生长但也不死亡。用来筛选营养缺陷型与温度敏感型等突变体。 2、间接选择法：无直接可供选择的表型指标，借助与突变表型有某种相关的特征作为间接选择指标。 3．常见的基因转化技术以及各自的优缺点有哪些？ 直接转化、介导转化、原生质体融合 （ 1 ） 基因资源丰富：植物、动物和微生物等； （２）转入的某性状具连续性和整体性； （３）育种周期短，成本低； （４）基因育种具不污染环境等优点