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1、资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载标签： 分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ probe ）,待测核酸序列可以是克隆的基因
2、征段，也可以是未克隆化的基因组 DNA 和细胞总 RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA 或 RNA片段。根据其来源和性质可分为 cDNA 探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA 探针等。固相杂交固相杂交（ solid-phase hybridization）是将变性的DNA 固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。斑步杂交（ dot hybridization）是道先将被测的DNA 或 RNA 变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA 或RNA 探针进行杂交。该法的特点是操作
3、简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。印迹杂交（ blotting hybridization）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档Southern 印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化
4、的DNA 片段，将凝胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA 片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。Northern 印迹杂交 :由 Southerm 印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA 分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。差异杂交（ differen
5、tial hybridization）是将基因组文库的重组噬菌体DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA 逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA 杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5左右），价值不大。cDNA 微点隈杂交（ cDNA microarray hybridization）是指将 cDNA 克隆或 cDNA 的 PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固
6、相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA 探针与微点阵上的DNA 进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotide microarray hybridization）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 21 页 - - - -
7、- - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为 20-50nt 的混合 RNA 或 cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA 的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点。液相杂交（ solution hbridization）指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链（探针）在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束
8、后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。递减杂交（ subtractive hybridizatio）是利用两种来源一致而功能不同的组织细胞提取mRNA（或逆转录成的cDNA）,在一定的条件下以过量的驱动mRNA 或 cDNA 与测试的单链cDNA 或 mRNA 进行液相杂交，通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体。经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分，保留特异表达的目的基因或工基因片段。以后者筛选cDNA 文库，可获得特异表达的目的基因cDNA 全长序列。核酸原位杂交用特定标记的已知顺序核酸作为探针与细胞级
9、或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法，称为核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）。用来检测DNA 在细胞核或染色休上的分布，与细胞内RNA 进行杂交以研究该组织细胞中特定基因表达水闰；还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的研究。该法的优点是特异性高，可精确定位；能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响；不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性；并可完整地保持组织与细胞的形态。因此被广泛应用于医学名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - -
10、 - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档生物学的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特异基因整合部物色检测等研究。近年来由定性发展到定量，方法更为完善。DNA 分子克隆技术（也称基因克隆技术）在体外将 DNA 分子片段与载体DNA 片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆 (或基因克隆 )。其基本步骤包括：制备目的基因将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA 重组导入宿主细胞筛选、鉴定扩增和表达。载体（ vecors）在细胞内自我
11、复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA 分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA 片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA 片段不同，有两种DNA 库，一种是基因组文库（genomic library ）,另一种是 cDNA 库。载体所谓载体是指携带靶DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb ，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。噬菌体（ phaeg
12、 ） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为 DNA 及其衍生系列。黏性质粒（ cosmid ） 是由质粒与噬菌体 DNA 组成的一种4-6kb 的环状杂种DNA。表达型载体将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。基因库的建造名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资
13、料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA 克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体； (2)DNA 片段的制备；（ 3）DNA 片段与载体DNA 的连接；（ 4）包装和接种。cDNA 库的建造是指克隆的DNA 片段，是由逆转录酶自mRNA 制备的 cDNA。cDNA 库包括某特定细胞的全部 cDNA 克隆的文库，不含内含子。特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测
14、其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。核酸序列测定DNA 的碱基序列决定着基因的特性，DNA 序列分析 （测序， sequencing ）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger 的双脱氧法等
15、，近年来已有DNA 序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA 的片段的 5 端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA 特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250 个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如： 2 ，3- 双脱氧核苷三磷酸ddNTP( 如 ddTTP、ddTTP、ddGTP 和 ddCTP中的一种 )掺入到 DNA 链中以终止链的延长，与掺入4 种正常的 dNTP 的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA 核苷酸序列，
16、根据碱基互补原则，可推算出模板DNA 分子的序列。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA 聚合酶，便随着M13 噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至
17、于RNA 测序现大多采用将mRNA 逆转录成 cDNA 后同测序，然后反推RNA 序列聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA 变性和复性原理在体外进行特定的DNA 片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1 个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100 万-200 万份拷贝。 PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量
18、复制的特异性DNA 片段。反应条件一般为94变性 30 秒，55退火 30 秒， 70-72 延伸 30-60 秒，共进行30 次循环左右，最后再延伸725分钟， 4冷却终止反应。1.逆转录 PCR(RT-PCR)用来扩增 RNA 的方法。2.竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度 RNA 定量的好方法。3.多重 PCR（multiples PCR ）在同一 PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的觳狻鐾荒宓募父銮颉?br 4.多种 PCR可同时加入多套以
19、生物素标记的引物起进手PCR反应。5.反向 PCR（iverse polymerase chain reaction）对一个已知的DNA 片段两侧的未知序列进行扩增和研究。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档6.不对称 PCR在扩增循环中引入不同引物浓度，以得到单链DNA 并进行列测定，以了解目的基因的序列。7.锚定 PCR（anchored polymerase
20、chain reaction）帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。8.着色互补试验或荧光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同荧光染粒，分别标记于不同寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA 片段，反应完毕后，利用分子筛选去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一DNA 区带荧光染料颜色的组合，如果某一DNA 区带荧光染色料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。
21、9.双温 PCR（two-temperature PCR）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是94-95 和 46-47 。可以提高反应的速度和特异性。上述这些 PCR技术的应用：（ 1）PCR技术扩增特定序列为基础，采用多种方法进行检测，如 PCR-RFLP、PCR-SSCP从已克隆的双链DNA 中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA 中产生特异性序列作为分子探针；（2）通过选择性扩增cDNA 中的特殊片段，产生针对尚未克隆的基因的探针；（3）从微量 mRNA 中产生cDNA 文库；（ 4）产生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突变；（ 6）做
22、染色体步移。10.原位 PCR技术： PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA 或 RNA 产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA 或 RNA 序列。而原位 PCR（In situ PCR, 简称 IS PCR），它可使扩增的特定DNA 片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，具有良好的应用前景。目前，已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世，使操作简便，软件灵活，已成为拉增固定细胞和石
23、蜡包埋组织中特定DNA 和 RNA序列的有用工具。IS PCR 的技术特点名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档（1）既具有 PCR的特异性与高灵敏性，又具有原位杂交的定位准确性；（2）测到低于 2 个拷贝量的细胞内特定DNA 序列，甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒 DNA；（ 3）有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析；（4）可用于正常或恶
24、性细胞，感染或非感染细胞的鉴定与区别。IS PCR 的基本方法IS-PCR 是 PCR和原位杂交两种技术的绫事，实质是一种将靶DNA 或 RNA 在原位扩增后再进行原位杂交的技术，操作程序基本兼有两种技术的所有过程，首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。初步应用有关原位 PCR技术应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna 病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过PCR扩增，仅用150 碱基对的短探针就可通过ISH 检查到了细胞内的visna 病毒。从开始在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(
25、原位杂交 )检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查。有传统的标记探针的原位PCR法（间接法），也有将标记物先标记PCR的引物，让标记物扩增后再行ISH 检查的直接法。因此，目前就原位PCR 方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位PCR技术中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的 DNA 或 mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。原位 PCR应用的课题，目前正片于开始阶段，
26、还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig 单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ 不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV 等；（ 2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、 Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品
27、文档基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection ）技术。基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。1.基因转移的非病毒方法直接注射法将含有 DNA 的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA 燕进行表达，在肌
28、细胞中，基因表达可持续数月。磷酸钙共沉淀法将氯化钙、 DNA 和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。脂质体染法指质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA 和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别。如若将DNA 在体内运送至肝内，可以选将DNA 和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联，以便通过细胞内吞过程而被摄入，这种DNA
29、大部分被肝脏所摄取。应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短，在评估实际应用前影上还在一些问题。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档显微注射法在显微镜下，将DNA 经同细胞玻璃针地接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作用支巧。电穿孔法 利用脉冲场将DNA 导入培养细胞。微粒子轰击法（基因枪）近几年发展较快的转移方法。使用高能微粒子
30、轰击将DNA 导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。胚胎干细胞法胚胎干细胞是从受精卵开始分裂至4 个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞，能在体外培养，可作为正面细胞，制备转基因动物，以研究基因定向整合或基因剔险及基因及能。精子载体法最近发现用精子和NDA-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，可捕获得物物，大大间化了转基因动物的制备过程。2.基因转移的病毒的方法病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具，病毒载体的优点有：（1）在转化
31、的细胞中传播重组的DNA 分子作为稳定的遗传成分；（2）在可能将有有制陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分 ，并能进分离；（4）转移效率较高。其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp 。目前常用的病毒载体有下列几种。逆转录病毒载体逆转录病毒辣为RNA 病毒，它们的基因组编码在一条单链RNA 他妇上，病毒进入细胞通过逆转录作用，病毒RNA 即转变为双链DNA 分子， DNA 进入细胞核并整合在细胞染色体中，这种整合的病毒称为原病毒。在原病毒的两端各有一长末端重复序列（ LTR）,LTR 内侧还有为复制所必需的其他顺序，
32、包括包装信号。目前常用的逆转病毒载体有CMV和 SV。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档DNA 病毒载体主要有腺病毒相关病毒载体，腺端正毒载体，疱疹病毒载体。对DNA病毒载体的研究是当前基因基因治疗研究中的重点领域。常用的基因转染技术将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA 送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有
33、多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：靶细胞的准备被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60% 为宜，转染当日，在转染前 4 小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4 小时换一次新鲜培养液。靶基因质粒DNA 的准备 用于转染的质粒DNA 必须无蛋白质，无RNA 和其了化学
34、物质的污染， OD260/280 比值应在 1.8 以上。应用酚 -氯仿抽提法制备的质粒DNA 一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48 小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48 小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin ）和新霉素（ neomycin ）。转基因动物的建立和应用
35、名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档转基因动物是以实验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内，使其稳定整合和遗传给后代动物。它主要采用显微注射法、逆转录病毒载体感染法、精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法。转基因动物模型的建立，推动了肿瘤在分子水平上的研究，它使人们认识到激活的原癌基因的异常表达及功能失常，是肿瘤发生的初阶段。将癌基因与特定细胞的调控
36、序列连在一起，可使癌基因在特定细胞中表达，研究靶细胞对不同癌基因的易感性，阐明某一癌基因对特定细胞生长、分化及功能的影响；它还可以研究多种基因的协同作用，有助于对多步骤致癌机进行深和的探讨。转基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，还可以通过使某一基因功能丢失（如用基因剔除技术）研究抑癌基因在肿瘤发一中的作用。另外，转基因小鼠对致癌原的测试，为肿瘤的预防，治疗及发现新的致癌物质都提供了有价值研究工具。基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985 以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因
37、的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA 序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR ）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由 PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex
38、 analysis,HA ）。下面分别介绍几种PCR 衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA 和 RNA 分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - -
39、 - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档检测小于 200bp 的 PCR产物时，突变检出率可达70-95，片段大于400bp 时，检出率仅为 50左右，该法可能会存在1的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar 等认为对于大于200bp 的片段，用其RNA分子来做 SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报
40、道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53 突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85以上的 p53 基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA 法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA 双链。由于突变和野生型DNA 形成的异源杂合双链DNA 在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA 不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是 SSCP分离的是单链DNA，HA 法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的
41、分析。但 HA 对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100。突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras 基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras 基因第 12 密码子的 BstNI 位点，第 13 密古巴子有Bg位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras 第 12、13 密码子的 DNA 片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA 片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturin
42、g gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE 法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA 区域，检出率可达100，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp 。基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA 变性湿度一致的凝胶位置时，DNA 发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA 链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的 PCR引物最好在5 末端加一段 40bp-50bp的 GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE
43、的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和 TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档化学切割错配法（chemical cleavage of mismatc
44、h,CCM）CCM为在 Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA 测序相仿。其基本原理为将待测含DNA 片段与相应的野生型DNA 片段或 DNA 和 RNA 片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C 能被羟胺或哌啶切割，错配的T 能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb 片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达 100。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10 个细胞中的1 个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodi
45、imide,CDI ）,CDI 为无毒物质，也可检测大片段DNA 的点突变。等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO 为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和 ASO相结合，设计一段20bp 左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品 DNA 杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因 AS
46、O 突变。DNA 芯片技术（ DNA chip ） DNA 芯片技术是90 年代后发展的一项DNA 分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA 合成等先进技术。可用于基因定位、DNA 测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA 芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA 排列在 1 块集成电路板上，彼此之间重叠1 个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常 DNA 和突变 DNA 发别与 2 块 DNA 芯片杂交，由于至少存在1 个碱基的差异，正常和突变的DNA 将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA
47、 分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。连接酶链反应（ ligase chain reaction,LCR ） 与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree 于 1988 年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以 DNA 连接酶将某一DNA 链的 5- 磷酸与另一相邻链3- 羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA 经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5- 磷酸与 3- 羟基形成磷名师资料总结
48、- - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 21 页 - - - - - - - - - 资料收集于网络如有侵权请联系网站删除 谢谢精品文档酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p 标记上游引物3 未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200 个靶分子。也可设计 1 个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。
49、Batt 在 1994 年发展了一种更为简的方法，好微孔板夹心杂交法。由于LCR 的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于 1989 年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS ）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5 端引物，一
50、个与正常DNA 互补，一个与突变DNA 互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3 端引物进行两个平行PCR，吸有与突变 DNA 完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3端则导致 PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和 ASPCR借鉴多重 PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA 有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T 时，这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA 聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3 端的第二个