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1、Vol-372016年5月高等学校化学学报CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIESNo510031009doi：107503cjcu20150907pH响应的PEG化基因传递体系刘亚杰，张鹏，杜建委，王幽香(浙江大学高分子合成与功能构造教育部重点实验室，高分子科学与工程学系，杭州310027)摘要制备了苯甲酰亚胺键偶联的聚乙二醇化(PEG化)聚乙烯亚胺(mPEGCHNPEI)，并以还原无pH响应特性mPEGPEI作为对照研究结果表明，PEG链段的引入并未影响聚乙烯亚胺与脱氧核糖核酸(DNA)分子的缔合，形成了尺寸为80 Bin，表面电位约为10 mV的基
2、因超分子组装体，具有很好的生理盐稳定性在模拟溶酶体的酸性环境下，苯甲酰亚胺键有效断裂，显示出很好的pH响应特性HepG2细胞培养结果表明，由于PEG链段有效屏蔽了组装体表面的正电荷，PEG化组装体的细胞毒性和内吞效率显著降低，但溶酶体酸性条件使苯甲酰亚胺键断裂，有利于组装体逃离溶酶体，因此mPEGCHNPEI依然具有很高的基因转染效率，实现了基因载体细胞外稳定传递、细胞内响应解离并高效转染的功能关键词非病毒基因载体；聚乙烯亚胺；pH响应；聚乙二醇化中图分类号06313；Q782 文献标志码A基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导人人体靶细胞，以纠正基因缺陷或发挥治疗作用，从而
3、达到治疗疾病目的的生物医学新技术。1 J基因治疗技术的发展有赖于安全有效的基因载体”23IBoussif等一纠以聚乙烯亚胺(PEI)作为非病毒载体，其独特的“质子海绵”效应有利于逃离溶酶体并进行高效转染，成为非病毒基因载体的黄金标准由于聚阳离子基因组装体在体内易发生聚集，从而被网状内皮系统清除，导致转染效率降低。6 o开发细胞外稳定传递、细胞内响应解离并高效转染的基因传递体系是当前的研究热点J细胞内外微环境(如谷胱甘肽浓度及pH值等)存在很大差别，利用细胞内外微环境的差异构建刺激响应的PEG化基因载体是解决上述问题的有效手段旧oLi等一。合成了含双硒键偶联的PEG化聚乙烯亚胺，在还原性谷胱甘肽
4、的作用下双硒键断裂，有利于细胞内PEG壳层的脱离，促使基因快速逃离溶酶体，实现高效转染溶酶体内部的pH值一般在4565之间，而正常组织的pH值为74，利用pH值的差异，人们将腙键或亚胺等化学键引入到基因载体中，构建了一系列具有pH响应特性的基因药物传递体系。114j基于此，本文制备了苯甲酰亚胺键偶联的聚乙二醇化(PEG化)聚乙烯亚胺(mPEGCHNPEI)，以硼氢化钠进一步还原得到无pH响应特性的mPEGPEI作为对照，采用体外细胞培养研究了PEG化基因载体的pH响应特性对逃离溶酶体能力和基因转染效率的影响1实验部分11试剂与仪器支化聚乙烯亚胺(bPEI，重均分子量为25104)、聚乙二醇甲醚
5、(mPEG，数均分子量为5103)和对甲酰基苯甲酸和四甲基偶氮唑盐(MTT)，AldrichSigma公司；二环己基碳二亚胺(DCC)、4二甲氨基吡啶(DMAP)和硼氢化钠(NaBH。)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；鱼精蛋白脱氧核糖核酸(钠盐)、N-2羟乙基哌嗪2乙磺酸(Hepes)和Cy3-DNA，生工生物工程(上海)股份有限公司；DulbeccoSmodified eagle medium(DMEM)高糖培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司美国Mercury一300 MHz核磁共振波谱仪(NMR)；英国Malvern公司Zetasizer Nano Z
6、S型光散射粒径分布仪(DLS)；日本NEC公司JEM1200EX型透射电子显微镜(TEM)；美国Becton Dickinson公司收稿日期：20151126网络出版日期：2016-0316基金项目：国家自然科学基金(批准号：21474087，51273177)资助联系人简介：王幽香，女，博士，副教授，主要从事生物医用高分子材料研究万方数据高等学校化学学报FACSCalibur型流式细胞仪；美国BioRad公司550型酶标仪及凝胶成像系统；德国Leica TSSP5型激光共聚焦显微镜(CLSM)12 mPEG-CHN-PEI和mPEG-PEI的合成参照文献14，15方法合成mPEGCHN-PE
7、I将5 g(1 mm01)聚乙二醇甲醚、15 g(10 mm01)对甲酰基苯甲酸、206 g(10 mm01)DCC和122 g(10 mm01)DMAP加入150 mL二氯甲烷中，室温下磁力搅拌反应48 h后过滤，滤液浓缩并用乙醇沉析3次，得到白色固体mPEGCHO调节bPEI与mPEG-CHO的投料摩尔比为1：6，在DMSO溶液中于40磁力搅拌反应48 h然后将反应液置于透析袋截留分子量(MWCO)为800014000中透析72 h，冷冻干燥得淡黄色粉末mPEG-CHN-PEI用硼氢化钠进一步还原mPEGCHNPEI，得到无pH响应特性的mPEGPEI作为对照将053g mPEGCHNPE
8、I溶于10 mL无水甲醇中，在冰浴条件下加入37 mg硼氢化钠，搅拌反应过夜，将反应液体置于透析袋中，先后用005 molL盐酸溶液及去离子水分别透析48 h，冷冻干燥得到mPEGPEI白色粉末13基因超分子组装体的制备以20 mmolL的Hepes缓冲液(NaCl=20 mmoLL，pH=74)为溶剂，将等体积的mPEGCHNPEI溶液与DNA溶液(200mL)相混合，漩涡混合30 S后，室温下静置30 min，得到mPEGCHNPEIDNA超分子组装体调节mPEGCHNPEI的浓度，得到不同NP比(mPEGCHNPEI中含有的氨基与DNA分子中含有的磷酸根基团的摩尔比)的超分子组装体按同样
9、的方法制备mPEGPEIDNA与PEIDNA超分子组装体作为对照用凝胶电泳研究超分子组装体的缔合特性；用光散射粒径分布仪(DLS)测定超分子组装体的粒径及表面电位；用TEM测定样品的微观形貌14基因超分子组装体的稳定性及pH响应性实验将NP比为10的mPEGCHNPEIDNA，mPEGPEIDNA与PEIDNA超分子组装体溶液的盐浓度调节至150 mmol,L，或与含10(体积分数)FBS的培养基混合y(组装体)：V(培养基)=1：3，用DLS测定基因超分子组装体的粒径随放置时间变化在mPEG-CHN-PEI的Hepes溶液中加入微量高浓度盐酸，调节pH值至50，置于摇床上于37cC下恒温振荡
10、3 h在pH值为50条件下，按上述方法制备NP比为10的超分子组装体用DLS测定组装体的表面电位，将组装体溶液的盐浓度调节至150 mmoL,L后，测定基因超分子组装体的粒径随时间的变化在相同条件下以mPEGPEIDNA基因超分子组装体作为对照组15细胞毒性用人肝癌细胞HepG2进行体外细胞培养实验，培养基为质量分数为10的FBS和1青霉素链霉素的DMEM高糖培养基，采用MTT法。1刮测定基因超分子组装体的细胞毒性在96孑L聚苯乙烯细胞培养板中种植1104 Cell孑L的HepG2细胞，24 h后换新鲜培养基，加入含1 Ixg DNA的mPEGCHNPEIDNA，mPEGPEIDNA或PEID
11、NA超分子组装体培养48 h后更换培养基，每孔加入20 IxL MTT溶液(5 mgmL磷酸盐缓冲液)，继续培养4 h后弃去培养基并加入200 IxL DMSO用荧光酶标仪检测570 nm处的吸光度，计算细胞活性16体外细胞转染以荧光素酶质粒pGL一3为报告基因，在24孔聚苯乙烯细胞培养板中种植5104 Cell：子L的HepG2细胞，加入含2 Ixg pGL-3的mPEGCHNPEIDNA，mPEGPEIDNA或PEIDNA组装体，孵育4 h后更换新鲜培养基继续孵育44 h，测定荧光活性利用荧光活性除以蛋白质总量并加以归一化处理，其结果以RLUmg protein(Relative ligh
12、t units per milligram protein)来表示17细胞内吞率在24孔聚苯乙烯细胞培养板中种植5x104 Cel蚜L的HepG2细胞，培养24 h后换新鲜培养基，分别加入NP比为10和20的含04斗g Cy3一DNA的mPEGCHNPEICy3一DNA，mPEG。PEICy3一DNA和PEICy3-DNA组装体孵育4 h后，用PBS洗涤细胞6次以除去细胞表面黏附的组装体，用胰酶消万方数据No5 刘亚杰等：pH响应的PEG化基因传递体系 1005化细胞，培养基终止消化，并分散在PBS中得到细胞悬浮液，用流式细胞仪检测细胞内吞率18胞内分布在共聚焦玻璃基底培养皿中种植5104 C
13、ell孑L的HepG2细胞，培养24 h后换新鲜培养基，加入NP比为10的含2斗g Cy3一DNA的mPEGCHNPEICy3一DNA，mPEGPEICy3一DNA或PEICy3-DNA组装体，孵育12 h后用PBS洗涤3次加入Lysotracker使溶酶体染色，采用激光共聚焦显微镜观察基因超分子组装体的胞内分布2结果与讨论21 mPEGCHN-PEI和mPEG-PEI的合成与表征mPEGCHO和mPEGCHNPEI的1H NMR谱图见图1在图1谱线口中，6 1012为醛基质子峰，6 823和795为苯环的质子峰，6 36为PEG的特征峰，6 332为与PEG相连的甲氧基端基的质子峰，说明合成
14、了mPEGCHO在图1谱线b中，6 1012处的醛基质子峰消失，艿2031处出现PEI的特征峰，说明制备了PEG化的聚阳离子基因载体根据PEG和PEI链段的特征峰面积计算可知，平均每个PEI链上接枝了53个PEG链段22基因超分子组装体的基本特性高效转染的聚阳离子载体必须具有良好的 MgJDNA缔合能力以保护其生物活性7|采用凝胶电f)1H NMR spectra of ml咂GCHO in CDa3(口)and m_PEG-CHNPEI in D20(b)泳研究PEG化基因载体的DNA缔合能力，结果见图2当NP比大于2时，PEG化基因载体的DNA的自由条带均消失，表明PEG链段的引入并未明显
15、影响聚阳离子缔合DNA的能力同时，聚阳离子缔合DNA形成尺寸合适的纳米粒子是聚阳离子高效转染的基本条件m1用DLS测定基因超分子组装体的尺寸及表面电位，结果示于图3在NP比为10和20时，PEI能与DNA通过静电组装形成尺寸B)pDNA()5 I 2 4 6 8 10 pDNA()5 2 4 6 8 1 0 pDNA()5 1 2 4 6 8 INP ratios of p013 cation to pDNA NP ratios of p013 cation to pDNA NP ratios of p01)cation to pDNAFig2 Agarose gel electrophore
16、sis assay of mPEG-CHNPEIDNA(A)，mPEG-PEIDNA(B)，PEIDNA(C)in 20 mmolL Hepes buffer solution(pH=74，20 mmolL NaCI)with various NP rati-OSA、 吻mPEG-CHiN-PEIDNA囫roPEGPEIDNA睦习PEI，DNAB1臣羽111PEGCH=NPEIDNA臣盈111 PEGPEIDNA6囚PEfDNA 女=弋一NP NPFig3 Particle sizes(A)and(-potentials(B)of different polyplexes in 20 mmoV
17、L Hepes buffer solution(pH=74，20 mmoVL NaCI)Frmr hars rPnrPsPnt mPan+SD fnr n= Denntes gtaligtlca|lv R；pn；nrat dlfierPnrP at nO05万方数据高等学校化学学报 V0137约为100 nm，表面电位约为30 mV的粒子；对于PEG化基因超分子组装体，由于PEG壳层的电荷屏蔽效应，使mPEGCHNPEIDNA和mPEGPEIDNA组装体的f一电位显著降低，粒径在80 nm左右，与文献19报道结果相符组装体的微观形貌如图4所示在NP比为10和20时，mPEGCHNPEIDNA和
18、mPEGPEIDNA组装体均呈现球形结构，尺寸与DLS测定结果相符Fig4 Typical TEM images of gene polyplexes at different NP ratiosAlI the polyplexes were prepared in 20 mmolL Hepes buffer solution(pH=74，20 mmolL NaCl)(A)mPEGCH 2 NPElDNA，NP=10；(B)mPEGCHNPEIDNA，NP=20；(C)mPEGPEIDNA，NP=10；(D)mPEGPEIDNA，NP=2023基因超分子组装体的稳定性及pH响应特性在pH=74
19、的条件下，配制NP比为10的mPEGCHN-PEIDNA，mPEG-PEIDNA和PEIDNA组装体，用DLS测定生理盐浓度和培养基中组装体的粒径变化趋势，结果如图5(A)所示可见，PEIDNA组装体在生理盐溶液中静置1 h后，很快发生聚集，粒径迅速增大至1m；由于PEG壳层的水合作用，PEG化基因组装体粒径变化很小，显示出较好的生理盐溶液稳定性由图5(B)可见，组装体均显示出良好的血清稳定性5()()(1500050lJ(5()3(1 6(1 9() 1 2I)l 5()180tmtnFig5 Time-dependent change of the particle sizes under
20、 physiological saltf 150 nunoVL NaCI)conditions(A)or culture media with 10FBS(B)(t=0 means at prepared condition)and孝-potentials ofvarious polyplexes at pH=50 and 74(C)(A)aPEIDNA，pH=74；bmPEGCHN-PEIDNA，pH=74；cmPEGPEIDNA，pH=74；dmPEGCHNPEIDNA，pH=50；emPEG-PEIDNA，pH=50(B)amPEGCH=NPEIDNA in DMEMwith 10(vo
21、lume fraction)FBS；bmPEGPELrDNA in DMEM with 10(volume fraction)FBS；CPEIDNA inDMEM with 10FBS(C)amPEGCH=NPEIDNA；bmPEGPEIDNAError bars represent meanSD for n=3$Denotes statistically significant difference at p005理想的基因传递体系不仅要求在体内循环中保持稳定，而且当到达靶向组织及细胞时，组装体还能发生有效解离并释放出包裹的DNA，从而实现高效转染构建刺激响应的基因传递体系是解决上述问题的有
22、效手段8。由于细胞溶酶体内的pH值较低(4565之间)，本文利用酸陛条件中苯甲酰亚胺键的快速断裂，实现细胞内PEG壳层的有效脱离将mPEGCHNPEI或mPEGPEI溶液的pH值调节至50，并置于摇床上于37恒温振荡3 h，在pH值为50条件下制备NP比为10的基因组装体，测定组装体的表面电位变化制备pH值为74的mPEGCHN-PEIDNA和mPEGPEIDNA组装体作为对照，结果如图5(C)所示在不同pH值下，mPEGPEIDNA组装体的表面电位几乎没有差异；而mPEGCHNPEIDNA组装体，在pH值为50的环境中处理3 h后，组装体电位由5 mV升高至17 mV，这是由于苯甲酰亚胺键的
23、断裂导致PEG壳层的脱卸，使基因组装体的表面电位上升从PEG化组装体在不同pH条件下的生理盐稳定性图5(A)可以看出，mPEGPEIDNA组装体均显示万方数据刘亚杰等：pH响应的PEG化基因传递体系 1007出很好的稳定性，随着静置时间延长粒径基本保持不变；但mPEGCHNPEIDNA组装体在pH值为50条件下，迅速增大到800 nm，进一步验证了苯甲酰亚胺键在低pH值下断裂，PEG壳层的脱离导致组装体在生理盐溶液中聚集的结论24细胞毒性及体外细胞转染采用MTI法测定组装体对HepG2细胞的毒性图6(B)由图6(A)可见，随着NP比的增大，细胞的存活率降低；在NP比为10时，PEIDNA的细胞
24、存活率为72，当NP比增大到20时，PEIDNA的细胞存活率仅为43，这是由于PEI的强正电性会扰动细胞膜忙o，21|，使PEI的细胞毒性增高在相同NP比下，PEG化组装体的细胞毒性显著低于PEIDNA组装体的细胞毒性，并且在NP比为20时细胞存活率仍高于70这是由于PEG壳层屏蔽表面的正电荷，削弱了组装体对细胞膜的扰动作用及PEG的生物相容性，使PEG化组装体的细胞毒性降低，这与Zhang等心21的研究结果相符一l()I摹鲁 8【j拿 6I二0 4(2(rA、 囫mPEGCH=NPEIDN7Ez固mPEGPEI，DNAp PEIIDNA二-=菩呈童菩芎麦一fBl匠盈inPEG-CHN-PEI
25、DNA 囫mPEGPEIDNA匦哥PEI，DNAFig6 Cell cytotoxicity of HepG2 cells exposed to different nanoparticles with 1 lag DNA after incubationfor鹌h(A)and in vitro transfection of the luciferase gene into HepG2 cells mediated by differentnanoparticles for 48 h(B)(A)Error bars represent mean+SD for n=5；(B)error bar
26、s represent meanSD for n：3Denotes statisticallysignificant difference at p005以荧光素酶质粒pGL一3为报告基因，采用HepG2细胞体外评价基因组装体的转染效果图6(B)由图6(B)可见，在相同NP比下，以PEIDNA组装体作为对照，PEG化基因组装体的转染效率有所降低，而mPEGCHN-PEIDNA组装体的转染效率显著高于mPEGPEIDNA组装体，但仍然低于对照组PEIDNA的转染效率这可能是由于苯甲酰亚胺键在溶酶体中的断裂导致PEG壳层的脱卸，使组装体更易逃离溶酶体，进而有利于DNA的释放和转染效率的提高但由于P
27、EG化组装体的内吞效率不如PEIDNA组装体的内吞效率，因此mPEG-CHN-PEIDNA组装体的转染效率仍低于对照组PEIDNA的转染效率25细胞内吞及胞内分布为了研究PEG化组装体转染效率差异的机理，采用Cy3DNA作为示踪分子，采用流式细胞仪研究HepG2细胞对不同基因超分子组装体的内吞效率为清除内吞后细胞表面附着的组装体，需要在内吞后使用PBS清洗多次由图7可见，PEG化组装体的内吞效率均低于20，显著低于PEICy3DNA组装体的内吞效率，这是由于PEG屏蔽了组装体表面的正电荷，阻碍了组装体与细胞膜的静电作用，内吞效率的降低影响了基因转染效率对比2种PEG化组装体的内吞数据可知，相同
28、NP比条件下，PEG化组装体的内吞效率无显著性差异，因此对于2种PEG化组装体，细胞内吞并不是5【J4(I=8 30!吾 2()导已。1 01 二IJN+)Fig7 Cellular uptake efficiency of differentnanoparticles by HepG2 cells for incubationof4 hError bars represent meanSD for n=3Denotesstatistically significant difference at p005万方数据1008 高等学校化学学报影响基因转染效率的主要原因bPEI的质子海绵效应有利于
29、基因传递体系快速逃离溶酶体，从而成为非病毒基因载体的黄金标准但PEG的引入可能影响bPEI的质子海绵效应，从而影响基因载体逃离溶酶体的能力因此，本文分别制备了NP比为10的PEICy3一DNA，mPEGCHNPEICy3一DNA和mPEG-PEICy3一DNA组装体并加入到HepG2细胞中，利用激光共聚焦显微镜观察组装体逃离溶酶体的情况孵育12 h后用PBS洗涤，并用LysoTracker9 Green DND-26给溶酶体染色其中含Cy3一DNA的组装体呈红色荧光，溶酶体染色后呈绿色荧光，红色荧光和绿色荧光重叠呈黄色荧光由图8可见，与PEICy3DNA组装体图8(c)相比，2种PEG化组装体
30、的红色荧光强度显著降低，说明PEG的引入显著降低了细胞内吞效率，与流式细胞仪定量测定结果相符另一方面，对于PEICy3一DNA和mPEGCHNPEICy3-DNA组装体图8(A)，几乎观察不到黄色荧光，说明这2种基因组装体能快速逃离溶酶体；而对于mPEGPEICy3一DNA组装体图8(B)，大部分的红色和绿色荧光重叠在一起，说明mPEGPEICy3DNA组装体不能有效逃离溶酶体因此，我们认为，由于溶酶体中较低的pH值导致苯甲酰亚胺Fig8 Intracellular distribution of Cv3-DNApolyplexed with mPEG-CHN-PEI(AlA3)，mPEG-P
31、EI(BlB3)and PEI(C1一C3)at an NP ratio ofl0(AlC1)Cy3；(A2一C2)LySO-Tracker；(A3一C3)Cy3+LvSO-Tracker键的断裂，PEG壳层的脱离能促进组装体迅速逃离溶酶体，显著促进了DNA的解离释放能力，有利于细胞内基因的高效转染综上所述，本文制备了苯甲酰亚胺键偶联的PEG化基因载体mPEGCHNPEI研究结果表明，PEG化组装体能有效缔合DNA，在模拟溶酶体内酸性环境下，苯甲酰亚胺键能有效断裂，显示出很好的pH响应特性细胞实验结果表明，由于PEG有效屏蔽了组装体表面的正电荷，PEG化组装体的细胞毒性和内吞效率显著降低，但由
32、于溶酶体酸性条件下，苯甲酰亚胺键的断裂有利于组装体迅速逃离溶酶体，因此mPEG-CHNPEI依然具有很高的基因转染效率，实现了基因载体细胞外稳定传递、细胞内响应解离并高效转染的功能参考文献1Wang YX，Chert P，Hu QL，Shen JC，Chem上Chinese Universities，2008，29(11)，2289-2293(王幽香，陈平，胡巧玲，沈家骢高等学校化学学报，2008，29(11)，2289-2293)2“u M，Chen B，Xue YN，Huang J，Zhang LM，Huang sw，Li QW，Zhang ZJ，Bioconjugate Chem蠡try
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41、olyethylenimine(mPEGPEI)without pHsensitivity was synthesized as contr01The resultsshowed that both PEGylated polycations could condense DNA into tight spherical nanoparticles about 80 nm insize and 10 mV in孝-potential，which showed excellent stability under physiological conditionsThe benzoicimine l
42、inkers were easily cleaved under the pH of 5，which was similar with the endosomal pHHumanhepatoblastoma cell line(HepG2)cell culture results indicated that the cytotoxicity and cellular uptake efficiency of both PEGylated gene nanoparticles decreased remarkably because of the shielding effect of PEG
43、shellDue to the cleavage of benzoic imine linker at acidic environment of endosomal，the PEG shell ofmPEGCHN-PEIDNA polyplexes was detachable and lead to quick endosomal escapeSo mPEG-CHNPEIDNA polyplexes showed higher gene expression than the mPEG-PEIDNA polyplexesBased onthese results，we concluded
44、that PEGylated polyplexes via benzoic imine linkers showed high extracellularstability，intracellular DNA release and effective gene transfectionKeywords Non-viral vector；P01yethylenimine；pHSensitive；PEGylation(Ed：W，Z)十Supposed by the National Natural Science Foundation of China(Nos21474087，51273177)万方数据