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1、质粒质粒DNADNA酶切酶切（质粒限制性内切酶消化酶切）质粒限制性内切酶消化酶切）实验五实验五背景知识背景知识一、质粒图谱的阅读二、限制性内切酶第一步第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 Ampr 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。 tetr 可以阻止四环素进入细胞。 camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素失活。一、质粒图谱的阅读一、质粒图谱的阅读第三步第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单
2、一切点。便于外源基因的插入。第四步第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：第五步：是否含有表达系统元件，即：启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。 这是用来区别克隆载体与表达载体的。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。pCAMBIA130210549 bpKanHPTGFPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUT
3、RlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)农杆菌复制起始位点农杆菌复制起始位点大肠杆菌复制起始位点大肠杆菌复制起始位点加尾信号，终止位点加尾信号，终止位点潮霉素抗性基因潮霉素抗性基因多克隆位点多克隆位点终止子加尾信号终止子加尾信号绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因二、限制性内切酶二、限制性内切酶1) 概念概念2) 命名原则命名原则3) 类型类型4) 基本特性及用途基本特性及用途5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素6)限制性核酸内切酶操作的注意事项限制性核酸内切酶操作的注意事项1) 概念概念限制性核酸内切酶限
4、制性核酸内切酶(restriction ednonuclease)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的内切核酸酶（endonuclease)的总称。 至2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。2) 命名原则命名原则1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)；第二、三个字母(小写，斜体)代表
5、宿主菌种名(species)。 第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 属名属名 种名种名 株系株系Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 Hind Hind同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3) 类型类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为性，可分为、型三类。型三类。主要特性主要特性型型型型型型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切
6、割位点应应 用用多功能异源三聚体ATP、 Mg2+ 、SAM距识别序列1kb处随机性切割不常用单功能同源三聚体Mg2+ 46bp回文序列识别序列内或附近特异切割常用常用双功能异源二聚体ATP、 Mg2+距识别序列下游2426bp处随机性切割数量很少，无实际作用4) 基本特性及用途基本特性及用途限制性核酸内切酶的主要用途限制性核酸内切酶的主要用途 在特异位点上切割在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。，产生特异的限制性酶片段。 建立建立DNA分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。 构建基因文库构建基因文库。 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 改
7、建质粒。改建质粒。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素 DNA样品纯度样品纯度 DNA样品甲基化程度样品甲基化程度 酶的星活性酶的星活性 (star activity) DNA样品纯度样品纯度 A） 虽不影响酶反应速度，但虽不影响酶反应速度，但RNA很易与酶蛋白发生很易与酶蛋白发生非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰非特异性结合而减少酶有效浓度，使酶解不彻底；另外，干扰DNA片段片段电泳观察。电泳观察。 B） 对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染对酶解影响不大，但若有核酸酶等蛋白质污染时，会干扰酶切反应，并影响酶解产物。时，会干扰酶切反应，并
8、影响酶解产物。 C） 如质粒如质粒DNA中杂有染色体中杂有染色体DNA，虽不影响，虽不影响酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 D） 如苯酚、氯仿、乙醇、如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，会影响等，会影响酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。酶切速度，甚至改变酶的识别特异性，出现酶的第二活性。 DNA样品甲基化程度样品甲基化程度 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应，则该DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一， DNA甲基化现象广泛的存在于原核和真
9、核生物中。 如：Acc识别序列能切割不能切割注意此处的区别dam甲基化酶识别序列AccT CCGG AGAT CCGG 6mATC 酶的星活性酶的星活性 (star activity)又称第二活力，是指改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。由于识别特异性的降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。高浓度甘油、高pH、低离子强度、巯基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存在可能导致酶产生星活性。6) 限制性核酸内切酶操作的注意事项限制性核酸内切酶操作的注意事项商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶；加入酶的
10、体积应不超过总体积的使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。时酶易产生星活性。整个操作应在整个操作应在0进行，即在冰浴中进行，而且是在加进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。入其它试剂之后，最后加入酶。当切割大量当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。用量。当当DNA需需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液；若没有种或以上酶切时，应用通用缓冲液；若没有通用缓冲液时，只有用通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶切产物，再进种酶切完后，纯化酶切
11、产物，再进行下一个酶切反应。行下一个酶切反应。 实验目的实验目的）了解酶切原理，掌握酶切体系建立原则）用EcoR 切割质粒pCAMBIA13023）用EcoR 切割银杏基因组DNA实验原理实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链近的特异位点上，并切割双链DNA。 限制性内切酶限制性内切酶EcoR 特异性识别位点为：特异性识别位点为：GATATC CTATAGGATATC CTATAG产生平末端：产生平末端：pCAMBIA130210549 bpKanHPTG
12、FPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUTRlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)则则pCAMBIA1302经经EcoR 酶切后产生大小分别为：酶切后产生大小分别为：1600bp、2624bp和和6325bp的三条的三条DNA 片段片段基因组基因组DNA中由于有较多的中由于有较多的EcoR 识别位点，因此，经识别位点，因此，经EcoR 酶切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一酶
13、切后产生大小不一的条带，电泳后整个泳道呈现均一的亮带。的亮带。酶切前的酶切前的DNA酶切后的酶切后的DNA实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：实验材料：质粒质粒pCAMBIA1302 银杏基因组银杏基因组DNA实验试剂：实验试剂： EcoR 酶及其酶切缓冲液酶及其酶切缓冲液 琼脂糖琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等电泳缓冲液等实验仪器实验仪器恒温水浴锅恒温水浴锅质粒质粒 （DNA）17.5L反应反应 10缓冲液缓冲液2L19L0.5L酶液酶液+用移液枪轻轻吹打使溶液混匀，且使溶液集中在管底用移液枪轻轻吹打使溶液混匀，且使溶液集中在管底混匀反应体系后，混匀反应体系后，37水浴保温水浴
14、保温4-5h琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测(上样上样10L电泳电泳)EP管编号管编号, 加样加样实验步骤实验步骤实验注意事项实验注意事项1. 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 2. 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 3. 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。 思考题思考题 如果一个如果一个DNA酶解液在电泳后发现酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能你认为可能是什么原因？是什么原因？