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1、实验目的实验目的 熟悉熟悉HPLC的工作原理的工作原理 熟悉熟悉HPLC在医疗实践中的应用在医疗实践中的应用 新药研究新药研究 药品生产药品生产 TDM 其他测定，如毒物，代谢产物，活性物质其他测定，如毒物，代谢产物，活性物质 了解了解HPLC在生物医学科研方面的应用在生物医学科研方面的应用 了解了解HPLC的操作方法的操作方法 了解生物样品了解生物样品(血、体液、组织血、体液、组织)处理过程处理过程High Performance Liquid Chromatography，HPLC Chromatography:最早源于对植物色素物最早源于对植物色素物质的提取，呈现不同颜色的谱带，故叫质的
2、提取，呈现不同颜色的谱带，故叫色色谱谱。流动相色谱的分类色谱的分类1 根据流动相根据流动相 以气体作流动相以气体作流动相气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC) 固定相为液体固定相为液体 气气-液色谱液色谱 固定相为固体固定相为固体 气气-固色谱固色谱 以液体作流动相以液体作流动相液相色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC) 固定相为液体固定相为液体 液液-液色谱液色谱 固定相为固体固定相为固体 液液-固色谱固色谱 超临界色谱超临界色谱流动相是在接近它的临界温度和压力下工流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体作的液体色谱的分类色谱的分类2 根
3、据固定相的附着方式根据固定相的附着方式 柱色谱柱色谱固定相装在圆柱管中固定相装在圆柱管中 平板色谱平板色谱 薄膜色谱薄膜色谱固定相涂敷在玻璃或金属板上固定相涂敷在玻璃或金属板上 纸色谱纸色谱液体固定相涂在纸上液体固定相涂在纸上色谱的分类色谱的分类3 根据极性根据极性 反相反相色谱色谱流动相极性固定相极性流动相极性固定相极性 正相色谱正相色谱流动相极性固定相极性流动相极性固定相极性色谱的分类色谱的分类4 根据分离机理根据分离机理 分配色谱分配色谱样品组分的分配系数不同样品组分的分配系数不同 吸附色谱吸附色谱 样品组分对固定相表面吸附力不同样品组分对固定相表面吸附力不同 体积排阻色谱体积排阻色谱利
4、用固定相孔径不同，把样品利用固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开组分按分子大小分开 离子交换色谱离子交换色谱不同离子与固定相内相反电荷不同离子与固定相内相反电荷间的作用力大小不同间的作用力大小不同基本原理基本原理 用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等比例的混合溶剂、缓冲液等流动相流动相(mobile phase，即两相中移动的一相，即两相中移动的一相)泵入装有泵入装有固定相固定相(stationary phase，即两相中固定不动的一相，即两相中固定不动的一相)的的色谱柱色谱柱,经进样阀注入经进样阀注入供试品供试品,由
5、流动相带入柱由流动相带入柱内内,由于溶于流动相中的各组分经过固定相时与固由于溶于流动相中的各组分经过固定相时与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间固定相中滞留时间不同不同，不同的物质顺序离开色谱柱，不同的物质顺序离开色谱柱,从而先后从固从而先后从固定相中流出。在柱内各成分被分离后定相中流出。在柱内各成分被分离后,通过通过检测器检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。来判断待侧物所含有的物质。基本概念基本
6、概念1. 色谱图色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile) 。2. 基线基线(base line)流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。3. 色谱峰色谱峰(peak)组分流经检测器时相应的连续信号产生组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称的曲线。流出曲线上的突起部分。正常
7、色谱峰近似于对称性正态分布曲线性正态分布曲线(高斯高斯Gauss曲线曲线) 。不对称色谱峰有两种：。不对称色谱峰有两种：前延峰前延峰(leading peak) 和拖尾峰和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。前者少见。4. 保留时间保留时间(retention time,tR)从进样开始到某个组分从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。在柱后出现浓度极大值的时间。5. 峰底峰底(peak base)基线上峰的起点至终点的距离。基线上峰的起点至终点的距离。6. 峰高峰高(peak height,h)峰的最高点至峰底的距离。峰的最高点至峰底的距离。7. 峰宽峰宽(peak wid
8、th,W)峰两侧峰两侧拐点拐点处所作两条切线与基处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。线的两个交点间的距离。W=4。8. 标准偏差标准偏差(standard error,)0.607倍峰高处所对应峰倍峰高处所对应峰宽之一半。宽之一半。9. 半峰宽半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)峰高一半处峰高一半处的峰宽。的峰宽。W h/22.355。10. 峰面积峰面积(peak area,A)峰与峰底所包围的面积。峰与峰底所包围的面积。 A=2.507h=1.064Wh/2h11. 死时间死时间(dead time,tM)不被固定相滞留的组分，从进不被固定相滞留的组分
9、，从进样到出现峰最大值所需的时间。样到出现峰最大值所需的时间。12.死体积死体积(dead volume,VM)不被固定相滞留的组分，不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的载气从进样到出现峰最大值所需的载气(液液)体积。体积。HPLC 系统：系统： Waters Alliance HPLC System; Waters 2420 ELSD层析管柱：层析管柱： Waters Carbohydrate Analysis Column 3.9 300 mm移动相：移动相： CH3CN:H2O = 75:25流速：流速： 1.4mL/min at 35 五种单糖五种单糖(Fructose,G
10、lucose) 及双糖及双糖(Sucrose ,Maltose,Lactose)分析结果分析结果吸附色谱吸附色谱（adsorption chromatography） 分离原理：固定相是固体分离原理：固定相是固体吸附剂吸附剂，吸附剂是多孔性微粒物，吸附剂是多孔性微粒物质，表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中心。质，表面有吸附中心。样品组分与流动相竞争吸附中心。各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留时间不同和实现分离。不同和实现分离。 固定相：固定相： 固定相通常是固定相通常是强极性强极性的硅胶、氧化铝、活性炭、的硅胶、氧化铝、活性
11、炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂。活性硅胶最常用活性硅胶最常用。 流动相：流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。乙腈等。 应用：应用： 对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效对于极性，结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。缺点是容易产生不对称峰和拖
12、尾现象。分配色谱分配色谱(partition chromatography) 原理：原理： 固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据固定液机械的吸附在惰性载体上，样品分子依据他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分他们在流动相和固定相间的溶解度不同，分别进入两相分配而实现分离。配而实现分离。 固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体固定相：将一种极性或非极性固定液吸附在惰性固相载体上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。上。如全多孔微粒硅胶吸附剂。 分类：根据极性不同分类：根据极性不同 正相分配色谱正相分配色谱固定相载体上涂布的是极性固定液；固定相载体上涂布的是极性固定液；流动相是非
13、极性溶剂；流动相是非极性溶剂；可分离极性较强的水溶性样品；可分离极性较强的水溶性样品；弱极性组分先洗脱出来。弱极性组分先洗脱出来。 反相分配色谱反相分配色谱固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；固定相载体上涂布的是非极性或弱极性固定液；流动相是极性溶剂；流动相是极性溶剂；强极性组分先洗脱出来。强极性组分先洗脱出来。 液液-液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动液分配色谱固定相中的固定液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，且不能进行梯度洗脱，已经不相中去，所以重现性很差，且不能进行梯度洗脱，已经不大为人们所采用。大为人们所采用。键合相色谱键合相色谱(bonded phase
14、chromatography ) 原理：将各种不同的有机官能团通过化学反应原理：将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合共价结合到固定相惰性到固定相惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。键合固定相优点：键合固定相优点： 对极性有机溶剂有良好的化学稳定性对极性有机溶剂有良好的化学稳定性 使色谱柱的柱效高、寿命长使色谱柱的柱效高、寿命长 实验重现性好实验重现性好 几乎适于各种类型的有机化合物的分离几乎适于各种类型的有机化合物的分离 可以梯度洗脱可以梯度洗脱分类：根据极性不同分类：根据极性不同 正相键合相色谱正相键合相色谱固定相极性流动相极性固定相极性
15、流动相极性固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分离固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分离脂类、水溶性的极性、强极性化合物脂类、水溶性的极性、强极性化合物 正相正相HPLC（normal phase HPLC）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 反相键合相色谱反相键合相色谱固定相极性流动相极性固定相极性
16、流动相极性固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的固定相：烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS柱或柱或C18柱就柱就是最典型的代表，其极性很小。适于分离非极性、弱极性离子型样品，是最典型的代表，其极性很小。适于分离非极性、弱极性离子型样品，是当今液相色谱的是当今液相色谱的最主要分离模式最主要分离模式。 反相反相HPLC（reversed phase HPLC）：）： 由非极性固定相和极性流动相所组由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶基键合硅胶(O
17、DS柱，柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流动相是甲醇，代表性的流动相是甲醇和乙腈。和乙腈。体积排阻色谱体积排阻色谱（size exclusion chromatograghy，SEC） 又称凝胶色谱和分子筛色谱又称凝胶色谱和分子筛色谱 原理：原理： 以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分
18、子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。 分类：根据样品性质分类：根据样品性质 凝胶过滤（凝胶过滤（GFC）用于分析水溶性样品，如多肽、用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖。蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖。 凝胶渗透（凝胶渗透（GPC）用于分析脂溶性样品，如测定高用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。聚物的分子量。离子交换色谱离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC） 分离原理：使用表面有离子交换基团的离分离原理：使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带
19、负电荷的交换基子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团团(如磺酸基和羧酸基如磺酸基和羧酸基)可以用于阳离子的分可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团离；带正电荷的交换基团(如季胺盐如季胺盐)可以用可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。不同，从而被相互分离。HPLC组成组成 HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、输液泵、色谱柱、检测器色谱柱、检
20、测器是关键部件。是关键部件。 有的仪器还有有的仪器还有梯度洗脱梯度洗脱装置、装置、在线脱气机在线脱气机、自动、自动进样器、预柱或保护柱、进样器、预柱或保护柱、柱温控制器柱温控制器等。等。 现代现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和器控制和数据处理数据处理。 制备型制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。仪还备有自动馏分收集装置。 输液泵输液泵 输液泵是输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能性。输液泵应具备如下
21、性能: 流量稳定，其流量稳定，其RSD(Relative Standard Deviation)应应0.5，这对定性定量的准确性至，这对定性定量的准确性至关重要；关重要； 流量范围宽，分析型应在流量范围宽，分析型应在0.110ml/min范围内范围内连续可调，制备型应能达到连续可调，制备型应能达到100ml/min； 输出压力高，一般应能达到输出压力高，一般应能达到150300kg/cm2： 液缸容积小；液缸容积小； 密封性能好，耐腐蚀。密封性能好，耐腐蚀。泵的分类泵的分类 泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋泵和恒流泵。恒流
22、泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太受柱阻影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰。目前应用最多的大，这两种泵己被淘汰。目前应用最多的是柱塞往复泵。柱塞往复泵的液缸容积小，是柱塞往复泵。柱塞往复泵的液缸容积小，可至可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱。特别适合于再循环和梯度洗脱。泵的使用和维护注意事项泵的使用和维护注意事项 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封
23、环、缸体和单向阀，因杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。此应预先除去流动相中的任何固体微粒。 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。的情况下。 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否输液泵的工作压力决不
24、要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。则会使高压密封环变形，产生漏液。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性。如果有大量气泡，泵就无法正常工作。量的稳定性。如果有大量气泡，泵就无法正常工作。梯度洗脱梯度洗脱 HPLC有等强度（有等强度（isocratic）和梯度）和梯度（gradient）洗脱两种方式。）洗脱两种方式。等度洗脱等度洗脱是在同一是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱梯度洗脱是在一是在一
25、个周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、个周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 进样器进样器 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用柱入口处。现在大都使用六通进样阀六通进样阀或自或自动进样器。进样装置要求：密封
26、性好，死动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。阀进样、自动进样。 六通进样阀六通进样阀 一般一般HPLC分析常采用六通进样阀。六通阀进分析常采用六通进样阀。六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。样方式有部分装液法和完全装液法两种。 用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的体积的50(最多最多75)，并要求每次进样体
27、积准，并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于取确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。 用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的体积的510倍倍9最少最少3倍），这样才能完全置换倍），这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项六通阀使用和维护注意事项 样品溶液进样前必须用样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，滤膜过滤，以减
28、少微粒对进样阀的磨损。以减少微粒对进样阀的磨损。 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；转到进样位增，甚至超过泵的最大压力；转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。时，过高的压力将使柱头损坏。 为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。再用水冲洗。 色谱柱色谱柱 色谱是一种分离分析手段，分离
29、是核心，色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。好，分析速度快等。 柱的使用和维护注意事项柱的使用和维护注意事项 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 应逐渐改变溶剂的组成，不应直接从有机溶剂改变为全部应逐渐改变溶剂的组成，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。是水，反之亦然。 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反
30、冲除去柱关的杂质时，才可以反冲除去柱关的杂质, ,否则反冲会迅速降低柱效。否则反冲会迅速降低柱效。 选择使用适宜的流动相选择使用适宜的流动相, ,尤其是尤其是pHpH，以避免固定相被破坏。，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱。有时可以在进样器前面连接一预柱。 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨, ,需需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以而且护柱。保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以而且应该经常更换。应该经常
31、更换。 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的2020倍左右，即倍左右，即常规分析需要常规分析需要50-7550-75l l。检测器检测器检测器是检测器是HPLC仪三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中仪三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。组分的量转变为电信号。HPLC的检测器要求灵敏度高、的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界
32、变化不敏感）、线性范围噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。宽、重复性好和适用范围广。 按原理分类可把检测器分为按原理分类可把检测器分为:光学检测器（如光学检测器（如紫外紫外、荧光、示差折光、蒸发光散热）、荧光、示差折光、蒸发光散热）热学检测器（如吸附热）热学检测器（如吸附热）电化学检测器（如极谱、库仑、安培）电化学检测器（如极谱、库仑、安培）电学检测器（如电导、介电常数）电学检测器（如电导、介电常数）放射性检测器（如闪烁计数、电子捕获）放射性检测器（如闪烁计数、电子捕获）氢火焰离子化检测器。氢火焰离子化检测器。紫外检测器紫外检测器(ultraviolet
33、 detector) 紫外检测器是紫外检测器是HPLC中应用最广泛的检测中应用最广泛的检测器，当检测波长为可见光时，又称为紫外器，当检测波长为可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高、噪音低、线性可见检测器。它灵敏度高、噪音低、线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏度高，因此即使是那些备色谱。由于灵敏度高，因此即使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用紫外光吸收小、消光系数低的物质也可用紫外检测器进行微量分析。但要注意流动相中检测器进行微量分析。但要注意流动相中各种溶剂的紫外吸收截止波长。各种溶剂的紫外吸收截止波长。数据处理和计算机控制
34、系统数据处理和计算机控制系统 计算机的用途包括三个方面：计算机的用途包括三个方面： （1）采集、处理和分析数据；）采集、处理和分析数据； （2）控制仪器；）控制仪器； （3）色谱系统化和专家系统。）色谱系统化和专家系统。使用范围使用范围 高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。的和天然的高分子化合物等。 它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物它们涉及石油化
35、工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的的80%。其余。其余20%的有机化合物，包括永久性气的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。用气相色谱法进行分析。流动相的处理流动相的处理 过滤溶剂过滤溶剂 溶剂在使用前一定要用溶剂在使用前一定要用0.5m的过滤器过滤，如的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样滤特别重要，不能让固体微粒污染
36、泵，阻塞进样器和柱头过滤片。过滤水溶性流动相时（如甲醇器和柱头过滤片。过滤水溶性流动相时（如甲醇/水），先用水），先用1-2ml甲醇润湿过滤膜，有助于快速甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。抽滤。 保持储液瓶的清洁保持储液瓶的清洁 用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。清洗过程中留下污迹。 保证溶剂的质量保证溶剂的质量 一定要用一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到级的溶剂，水也应达到HPLC级，级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。同样也要使用高纯度的缓冲
37、盐。 故障及解决方法故障及解决方法 故障故障1：流动相脱气不充分：流动相脱气不充分 原因：流动相受热，或者流动相不同组分混原因：流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。 解决方法：流动相再脱气；采用更有效的脱解决方法：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。为系统外预混合。故障故障2：流动相供给不畅：流动相供给不畅 原因原因1：流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。：流动相用完
38、，管道中吸入气体引起泵压力不稳。解决办法：解决办法：1应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。分析完毕。2输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。住进液管，使其不能上下移动。原因原因2：过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞：过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉。或长霉。解决办法：去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的解决办法：去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出
39、问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。原因原因3：流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内：流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10ml/min，常会出现这种，常会出现这种现象。现象。解决办法：（解决办法：（1）使用低流速；（）使用低流速；（2）换大孔
40、径的过滤器；（）换大孔径的过滤器；（3）增加进液管）增加进液管道内径；（道内径；（4）抬高或加压储液器；（）抬高或加压储液器；（5）不用过滤器，但流动相一定要）不用过滤器，但流动相一定要先过滤；（先过滤；（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；（的缝隙；（7）进液管道阻塞或弯曲使）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。松动、泵
41、部件损坏等，都能引起供液不正常。故障故障3：流动相和储液器被污染：流动相和储液器被污染 原因：由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵原因：由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加
42、进新的流动相或系统用得太久然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储了细菌。脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。液器，或者定期报废储液器。原因：流动相污染来自这几个方面：试剂质量不高，玻璃器皿不合格；原因：流动相污染来自这几个方面：试剂质量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影响；配制流动相时操作不当等。微生物的影响；配制流动相时操作不当等。 解决办法：要求高纯度化
43、学试剂和解决办法：要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。玻璃器皿按规定清洗级溶剂。玻璃器皿按规定清洗干净。为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统。怀疑系统内生长干净。为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统。怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统）。真了微生物，可用稀硝酸冲洗既可（注意不要损坏柱和管道系统）。真空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和空脱气时防止泵油带入流动相。用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。玻璃器皿配制流动相。已经污染的流动相一定要废弃掉。生物样品处理原则生物样品处理原则 生物样品
44、种类生物样品种类 血血 体液体液 组织组织 处理原则处理原则 提取提取 纯化纯化 不破坏不破坏 易溶解易溶解苯浓度的测定苯浓度的测定 目的：目的： 原理：原理： 实验器材：实验器材： 试剂药品：试剂药品： 操作步骤：操作步骤：仪器、试剂及条件仪器、试剂及条件主要仪器主要仪器Waters 600 高效液相色谱仪高效液相色谱仪Waters 2487紫外检测器紫外检测器Auto science 真空脱气仪真空脱气仪色谱柱：菲罗门色谱柱：菲罗门 Gemini C18 250mm反相色谱柱反相色谱柱ChromStation 色谱数据系统色谱数据系统 (version 5.3)主要试剂、药品主要试剂、药品
45、苯苯 乙腈乙腈 超纯水超纯水 实验条件实验条件检测波长：检测波长：254nm流动相：乙腈：水流动相：乙腈：水 65：35流速：流速：1ml/min柱温：柱温：30度度保留时间：保留时间：6分钟左右分钟左右苯储备液浓度：苯储备液浓度：1ul/1ml(流动相溶解流动相溶解)进样量：进样量：100ul进样器，进样器，20ul定量环定量环实验操作程序实验操作程序开机调试：开机调试： 选择液体选择液体(流动相流动相)流速流速1ml/min，流动相为乙腈，流动相为乙腈 水水(65 35)，柱温，柱温30。标准曲线的制作标准曲线的制作 精密吸取苯精密吸取苯50ul，置，置50ml容量瓶中，用流动相为乙腈容量
46、瓶中，用流动相为乙腈 水水(65 35)溶解溶解并定容得并定容得1l /ml的溶液的溶液 。 取流动相溶解的含苯溶液取流动相溶解的含苯溶液1ml置小试管中，加入置小试管中，加入1ml流动相稀释，即得流动相稀释，即得0.5l /ml的标准样本液，混匀后取此标准本液的标准样本液，混匀后取此标准本液1 ml，加入，加入1ml流动相稀释，流动相稀释，得得0.25l /ml的含药标准样本液，混匀后再以此方法逐步梯度稀释，得的含药标准样本液，混匀后再以此方法逐步梯度稀释，得0.125，0.0625l/ml浓度的共计浓度的共计5份含药标准样本液。份含药标准样本液。 用用100l微量注射器吸取样本液微量注射器
47、吸取样本液100l通过通过20 ul定量环进样进样定量环进样进样20ul，记，记下出峰后积分的峰面积。用下出峰后积分的峰面积。用Curve expert 1.3软件根据峰面积和配制浓度软件根据峰面积和配制浓度关系计算出标准曲线。关系计算出标准曲线。样品测定样品测定 待测溶液的配制：将苯用流动相溶解后，配制成一定浓度的溶液。（教待测溶液的配制：将苯用流动相溶解后，配制成一定浓度的溶液。（教师完成）师完成） 分别用分别用100l微量注射器吸取样本液微量注射器吸取样本液100l通过通过20 ul定量环进样进样定量环进样进样20ul，记下出峰后积分的峰面积。根据标准曲线计算出待测物的浓度。记下出峰后积
48、分的峰面积。根据标准曲线计算出待测物的浓度。注意事项注意事项 实验室纪律实验室纪律 分组、分工分组、分工 后续课程安排提示后续课程安排提示 清洁清洁 实验结束后，关闭紫外检测器，然后继续实验结束后，关闭紫外检测器，然后继续以以1ml/min乙腈乙腈 水水(65 35)流动相冲洗系流动相冲洗系统统30min，然后逐渐将流动相切换成乙，然后逐渐将流动相切换成乙腈腈 水水(95 5) ，以流速，以流速1ml/min冲洗系统冲洗系统及柱子及柱子20分钟后，关闭色谱仪。分钟后，关闭色谱仪。 AUFS - absorbance unit full scale 全程吸光度 原原 理理 色谱法的分离原理是：溶
49、于流动相（色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过流动相时，由于与固定）中的各组分经过流动相时，由于与固定相（相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在流动相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流流动相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。出。 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。