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1、版药典微生物限度检查方法验证方案 版药典微生物限度检查 方法验证方案 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2022GT 人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。 目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 试验菌株 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证离心沉淀
2、-薄膜过滤法 控制菌检查方法验证离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审 1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照中国药典2022版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
3、本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由
4、质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作， 并将该次的培训记录归档。 验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2022年12月至2022年1月。5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 .主要检验仪器设备确认表 检查人/日期：复核人/
5、日期： .验证所需文件的确认表 检查人/日期：复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 .试验菌种检查表 检查人/日期：复核人/日期：试验所需的培养基检查 检查人/日期：复核人/日期： .检验样品确认表 检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法 试验菌株 人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。需氧菌总数检查、霉菌和
6、酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，3035培养1824小时，取此培养液1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养23天，取此培养液1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/ml的菌悬液备用。 接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，2025培养57天，直到获得丰富的孢子。加入35ml含有%聚
7、山梨酯80的%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加含有%聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，制成50100cfu/m的孢子悬液备用。 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 ,在验证过的贮存期内使用。 验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。 . 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证-常规倾注平皿法 供试液的制备 取供试品10g，加%无菌氯化钠溶液至100ml，振摇，制成1：10的供试液。 试验组 取1：10的供试液1ml和项下制备的50100cfu的试
8、验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 另取1：10的供试液1ml和项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。 取1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养5天，点计菌落数。 另取
9、1：10的供试液1ml注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。 取%无菌氯化钠溶液1ml和项下制备的50100cfu的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置3035培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 另取%无菌氯化钠溶液1ml和项下制备的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀，每株试验菌
10、株平行制备2个平皿。置2025培养箱中培养5天，点计菌落数。 常规倾注平皿法方法验证的接受标准 试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率)应在0 .5?2 范围内。 常规倾注平皿法方法验证的结果 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果 试验次数1： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天 试验人/日期：复核人/日期：试验次数2： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天 试验人/日期：复核人/日期：试验次数3： 人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天