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1、质粒 DNA 的提取、纯化及验证姓名：肖风学号： 201000100122 2010级生物工程一、 【实验目的】1、 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。2 、掌握质粒 DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。3 、学习并掌握凝胶电泳进行DNA 的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中 DNA 的分离纯化方法。二、 【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒 DNA 的方法很多，目前常用的有： 碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、 EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用， 适于不同量
2、质粒 DNA 的提取。该方法操作简单， 易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA 纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒 DNA 一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA 。在细菌细胞中， 染色体 DNA以双螺旋结构存在， 质粒 DNA 以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后， 染色体 DNA 和质粒 DNA均被释放出来， 但是两者变性与复性所依赖的溶液 pH值不同。在 pH值高达 120 的碱性溶液中， 染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性； 共价闭合环状质粒DNA 的大部分氢键断裂， 但两条互补链不完全分离。 当用 p
3、H值 46 的 KAc(或 NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA 可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体 DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子RNA 、蛋白质一 SDS复合物等一起形成缠连的、 可见的白色絮状沉淀。 这种沉淀通过离心， 与复性的溶于溶液的质粒 DNA分离。溶于上清液的质粒DNA ，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于 DNA与 RNA性质类似，乙醇沉淀DNA 的同时，也伴随着RNA 沉淀，可利用 RNase A将 RNA 降解。质粒 DNA溶液中的 RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒
4、DNA 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 8 页 - - - - - - - - - 2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA 的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或 SYBR Gold 染色直接观察到，甚至含量少至 20 Pg的双链 DNA 在紫外激发下也能直接检测到。 需要的话，这些分离的 DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中， 常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰
5、胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、 大小和孔径， 也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作， 适用于核酸电泳， 测定 DNA 的相对分子质量， 分离经限制酶水解的 DNA 片段，进一步纯化DNA 等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6 个因素：(1) 样品 DNA 分子的大小 ：电泳时，线性双螺旋 DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基 )的对数值成反比， 这是因为大分子有更大的摩擦阻力。(2)DNA 分子的构象：相对分子质量相同而构象不同
6、的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒 DNA 过程中，由于各种因素的影响， 使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环 DNA(open circle DNA ，oeDNA) 分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1iner DNA ，L DNA) 分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。(3) 琼脂糖浓度： 琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，
7、 则凝胶孔径越大，DNA 电泳迁移速度越快， 因此，相对分子质量越大， 选用的凝胶浓度应越低。(4) 电泳所用电场： 低电压条件下，线性DNA 片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得 DNA 片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 Vcm 。(5) 缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - -
8、 第 2 页，共 8 页 - - - - - - - - - 子水( 如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA 几乎不移动； 而在高离子强度下 (如错用 10电泳缓冲液 )，导电性极高， 带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。(6) 温度： 琼脂糖凝胶电泳时，不同大小 DNA 片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于05时，凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。三、 【实验材料】恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴锅；1.5mL 离心管， 50mL离心管，不同型号的吸头，
9、微量移液器等。菌体： E.coli DH5 受体菌，具有 Ampr标记的质粒 pUC19 微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf 管，刀片，塑料薄膜等。酶切后的 DNA 样品或其他待分离纯化的DNA 样品；琼脂糖， TAE缓冲液，溴化乙锭（EB ） ，6上样缓冲液， DNA 相对分子质量标准物DNA Marker /Hind III，5 mol/L pH5.2的醋酸钠，无水乙醇。四、 【实验步骤】（一） 、实验前准备1、LB培养液 +1% 葡萄糖按照附录所示配方配制LB培养液，并添加 1% 葡萄糖， 115灭菌 30min，分别分装于 100m
10、L锥形瓶中 20mL ，300mL锥形瓶中 50mL ；同时配制固体培养基用于活化菌株。2、枪尖： 1000L（蓝色） 、200L（黄色） 、20L（白色） ，灭菌备用3、离心管： 1.5mL 离心管于 500mL锥形瓶中， 50mL离心管 2 支，灭菌备用4、吸管： 10mL吸管，灭菌备用（二 ） 、质粒提取1、细胞培养在含有氨苄青霉素的LB 平板上挑去携带有质粒pUC19的 E.coli 单菌落，接种名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 8 页 - - -
11、- - - - - - 于 20mL含氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37振荡培养过夜。 将过夜培养液吸取 23mL接种到 50mL含有氨苄青霉素的LB培养基中， 37培养 46h，即到达菌体生长的对数晚期。2、 质粒提取2.1. 取 30mL菌液于 50mL灭菌离心管中， 在 7000r/min 条件下离心 5min，弃去上清液，收集菌体细胞。空管质量为15.570g。2.2. 向离心管中加入 5mL冰箱预冷的溶液， 加入溶液 I 主要是为了打散菌体，使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬液，为下一步破碎菌体做准备， 可剧烈振荡，此时细胞尚未破裂，不用担心染色体断裂。为节省时间，可在漩涡振荡仪上混匀
12、。通过步骤（ 1）离心，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽，用吸水纸擦干，称量菌体质量，为15.742-15.570=0.172g 。2.3. 按湿菌体质量：溶液I 体积=100mg ：1mL的比例加入用冰箱预冷的溶液 I （2mL ） ，剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于碎冰中冰浴5min 2.4. 以 2 倍体积加入新配制的溶液 （4mL ） ，轻摇轻加， 至半透明溶液形成。此步是 DNA变性的关键步骤，加入溶液II 后，菌悬液 pH上升到 12 左右，为强碱性， 破坏大肠杆菌 （G-）细胞壁，此时，溶液变粘稠、 透明，无菌块残留，因为染色体 DNA与质粒 DNA 均变性溶解于
13、强碱溶液中， 蛋白质也溶于溶液中， 但质粒 DNA双链不完全分离。 因此步染色体 DNA 释放，故动作必须轻柔， 不能剧烈震荡，否则染色体 DNA 会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解于溶液中，与质粒DNA 混合在一起，不利于质粒DNA 提纯。可缓慢上下颠倒离心管数次，既要使试剂与染色体 DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。2.5. 以 1.5 倍溶液 I 体积量加入冰箱预冷的溶液 （3mL ） ，轻加轻摇， 慢慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上10min，此时有白色絮状沉淀物。 此步是质粒 DNA 复性的关键步骤。 动作要轻柔，理由同上。同时可减少对质粒DNA
14、 的破坏，使其保持超螺旋闭环结构。2.6. 12000r/min 离心 15min，将上清液轻轻转移到另一洁净离心管中，向上清液中加入 1/10 体积的 3mol/mL 的 NaAc和 2 倍体积的冰无水乙醇， 混匀，-20下静置 30min，沉淀 DNA 。2.7. 如（6）中离心 15min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 8 页 - - - - - - - - - 以使所有的液体流出。2.8. 向沉淀物中加入70
15、% 乙醇 3mL ，不打散沉淀洗涤一遍。 12000r/min离心 5min，弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥。2.9. 将 DNA沉淀溶于 1mLTE缓冲液中，加入RNase A （终浓度大于50g/mL） 。37保温 0.5 1h。3 质粒 DNA 的纯化3.1. 将上述 DNA 溶液平分在 2 个 1.5mL 的微量离心管中，每管0.5mL，分别加入等体积的Tris 饱和苯酚溶液，混匀， 7000r/min 离心 5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。 离心后，苯酚位于离心管的最下方， 蛋白质层位于中间，溶解有质粒 DNA 的水层位于最上方。 离心管从离心机里取出后， 尽
16、量减少晃动，以免蛋白层污染DNA水溶液，使分界面模糊、不清晰，不利于下一步分离。使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时，一定要戴橡胶手套， 注意安全。 一旦皮肤被苯酚等污染，立即用大量水清洗。3.2. 加入等体积苯酚 : 氯仿（ 1:1 ）混合液，混匀， 7000r/min 离心 5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。3.3. 加入等体积氯仿溶液， 混匀，7000r/min 离心 5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。3.4. 加入 2 倍体积的无水乙醇， 1/10 体积的 3mol/L NaAc 溶液，混合均匀，于-20沉淀 0.5h 以上。沉淀质粒 DNA 可采用无水乙醇， 需在低温条
17、件下静置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类，低温条件可保证 DNA 水解酶类保持在低活性，以减少其对DNA的降解。用 70% 的乙醇洗涤质粒DNA 沉淀，主要目的是利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入RNase A前洗涤去盐类，可保证酶活不受其影响。3.5. 12000r/min 离心 15min，收集沉淀，弃去上清液并干燥。3.6. 在沉淀DNA中，加入70% 乙醇200L，不打散沉淀洗涤一次，12000r/min 离心 1min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上使所有的液体流出，室温干燥。3.7. 用 50L TE溶液重新溶解 DNA ，温和震荡几秒钟，备用。溶解沉淀时，为获得最
18、大量产品，应逐滴加入溶剂，边加边摇；尽量少转动离心管，避免名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 8 页 - - - - - - - - - 过多样品粘于壁上导致损失。4 DNA纯度检测（ 0.9%琼脂糖凝胶电泳法）4.1. 制板4.1.1.称量 0.36g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入40mL 1TAE缓冲液，在微波炉中加热，使琼脂糖融化。4.1.2.待凝胶温度降至大约55以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握得住） 。4.1.3.在模具上插入一个合适的梳子形成加样
19、孔（如果待回收的DNA体积较大时，可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住，使之形成较大的孔）。梳齿的位置应在托盘底面上0.51.00mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。4.1.4.将凝胶倒入准备好的制胶模具中，等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状（月 30min） ，将梳子轻轻拔出。4.1.5.用拇指和食指轻移胶版两侧，将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。4.2. 电泳4.2.1.取 3L 质粒样品 +1L 电泳载样液，在塑料薄膜上用微量移液管吹吸混匀，加入到凝胶孔中， 枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。吹洗法混匀少量液体时需注意避免产生气
20、泡，增加操作难度和误差。 用微量移液器吸进液体时应该小心， 避免产生气泡；吹出液体时，不要将液体从针尖口完全吹出，要留一滴在针尖口处，可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解， 不至于损失。注意，在塑料薄膜上混匀buffer和 DNA 样品时，枪尖不要太倾斜，以免吹走液滴。4.2.2.取适量上样缓冲液和一定量的待分离纯化的DNA 样品 （如酶切产物、PCR 产物等）滴在塑料薄膜上，混合均匀后一同加入到凝胶孔中，样品应沉于孔底 （混合液比重大）。 此外，在相邻的加样孔中加入合适的DNA Marker （如/Hind III 3L） 。4.2.3. 点样完成
21、后，盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳压（一般是5V/cm）以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA 样品从负极向正极移动。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 8 页 - - - - - - - - - 4.2.4. 当前沿 DNA 接近胶的前端时， 切断电源，停止电泳（大约 1h， 100V ） ，打开槽盖。4.2.5.用溴化乙锭染色 10min 后，用凝胶成像仪观察，记录结果。六、 【实验结果及分析】实验结果图：图 1 各组质粒DNA 电泳条带结果分析：1
22、、从胶的左边开始，各条带分别是： （1）pUC19 （2）DNA marker（3）-（14）为各组提取的质粒DNA 带2、从左开始第三条带是我们组的电泳带。以左边第二条为例，从上到下依次是：蛋白质，染色体 DNA杂带，开环质粒 DNA 带，线形质粒 DNA带，超螺旋质粒DNA 带（主带） ，RNA 带。3、由图可见，我们组提取的质粒DNA 样品中，染色体 DNA 、蛋白质带明显比其他一些组和 marker 带亮，说明抽提的不太干净，含少量杂蛋白，纯度不高。原因是在纯化的过程中未能将蛋白质除尽，吸取上清的时候也可能带进少量的蛋白质。4、 我们提取出的质粒 DNA 中开环质粒 DNA 和线性质粒
23、 DNA 的电泳条带不清晰，由亮度可知含量也较少。 相对来说， 开环质粒 DNA的含量比线性的要多一点。 而超螺旋质粒 DNA带相对于其他组较暗， 说明所提取的该质粒含量较少， 操作不如名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 8 页 - - - - - - - - - 其他组规范，损失了部分DNA 。七、 【实验总结】我们组提取的质粒DNA 的数量和质量不够理想，掺杂了少量的蛋白质与染色体 DNA，而所要提取的超螺旋质粒DNA 含量较少，原因是多方面的，其一是在质粒提取的过程中，用碱处理时，染色体DNA 可能没有完全被打散；其二是质粒纯化的过程中， 吸取上清液时混入了蛋白质，且操作次数少， 蛋白可能有部分没有变性。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 8 页 - - - - - - - - -