2022年生物工程与下游技术知识点整理.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 生物工程与下游技术学问点整理第十三章 内酰胺类抗生素1、（把握青霉素的性质并分析流程,会设计提取分别纯化的流程）青霉素的理化性质（1）酸碱性：有一个酸性基团；解离常数 pK 值为 2.7；（2）溶解度：青霉素是有机酸,易溶于醇,酸,醚,酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小,快速丢失抗菌才能；青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇,丁醇,酮类,醋酸乙酯；含有少量水分时,溶解度大大增加；不溶于乙醚,氯仿,醋酸戊酯；青霉素的分别纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本 277 页发酵液,冷到10下,1/3 体积中性过滤,板框压

2、滤或鼓式过滤,10硫酸调 pH5,加 PPB 溶液（十五烷基溴化吡啶,絮凝剂）量 2030；滤洗液；,板框过滤或鼓式过滤,冲水加 1/3BA （醋酸丁酯） ,加 PPB,10硫酸调 pH22.5,逆流萃取；得一次丁酯萃取液；加 0.3活性炭搅拌 10min ,压滤,10冷冻脱水,水分在 0.9%以下,过滤得 BA 清液；加温到 15,加醋酸钾乙醇溶液适当搅拌,结晶后静置1h 以下,甩滤,得湿晶体；湿晶体放洗涤罐,丁醇（4 6L/10 亿）洗涤,乙酸乙酯（2L/10 亿）顶洗,挖出粉子真空干燥；得青霉素 G 钾盐成品；2、头孢菌素 C （1）头孢菌素 C 性质： 为两性化合物,C 为氨基酸,水溶

3、性很大,稳固性差；大孔网状吸附剂 从发酵液中初步分别头 C,离子交换法纯化,络盐 沉淀法 结晶；（2）分别纯化工艺流程头 C 发酵液,硫酸酸化,板框过滤,得头 C 滤液；大孔网状吸附剂吸附,得饱和树脂；丙酮水溶液解吸,得一次头 C 解吸液；阴离子树脂吸附,醋酸钠解吸；加醋酸锌,得头C 锌络盐结晶；板框过滤,得头C 锌盐湿品；气流干燥,得头C 锌盐成品；（3）头 C 分别纯化工艺要点A、发酵液预处理发酵液冷到 15以下, 硫酸酸化到 pH2.5 3,放置一段时间； 板框或真空鼓式过滤机过滤,并用水顶洗滤渣；收集,合并滤液,洗液,低温 10储存；B、 大孔网状吸附剂的吸附和解吸头 C 最适吸附 p

4、H2.5 3,XAD4 的吸附容量为 1520g/L；24 倍体积去离子水 洗涤,除去硫酸根等阴离子,以免干扰离子交换树脂的纯化；1525乙醇,丙酮,或异丙醇水溶液来解吸；C、离子交换树脂的纯化采纳 弱碱性阴离子交换树脂,树脂用醋酸溶液处理成醋酸型,开头吸附；去离子水洗涤树脂,1.52.5醋酸钠（钾）水溶液解吸；D、沉淀结晶名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 头 C 可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni 形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍 ；头 C 锌盐,淡黄色微晶粉末,不溶于水及氯仿,甲醇,乙醇；离子交换解吸液,放结晶

5、罐中,5 ,加醋酸锌 ,搅拌溶解, 加结晶液体积 30的乙醇或丙酮,析出头 C 锌盐微晶沉淀；挑选性较差,需在肯定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头 C 溶液；E、膜分别发酵液通过 微孔滤膜 MF ,除去菌丝,固形物；超滤 UF （除大分子物质） ,除去分子量 浅的头 C 滤液；反渗透膜 RO 浓缩（ 除水 ）3、克拉维酸的分别纯化（1）萃取：溶剂萃取法10000 以上的蛋白质,多糖,深棕色色素,获得色发酵滤液, 盐酸调 pH2 ,3/4 体积 正丁醇,多级逆流萃取,5萃取；1/20 体积水,用 20氢氧化钠水溶液调 pH7 ；液液离心机,水相反抽提液；浓缩洗脱液, 5Zerolit

6、FFIP 氯型阴离子交换树脂,0 0.35M 氯化钠梯度吸脱,合并活性部分,减压浓缩；Amberlite XAD4树脂脱盐,能吸附克拉维酸,不吸附无机盐； 1正丁醇或无盐水洗脱,混合活性部分,真空浓缩和冷冻干燥；（2） 离子交换：吸附于强碱性阴离子交换树脂上,用含盐水溶液洗脱；发酵滤液, pH6.2,通过 Zerolit FFIP 氯型强碱性阴离子交换树脂,冷的 1mol/L 氯化钠洗脱；浓缩液, pH6,25的滤液, 通过 Amberlite XAD4 树脂 ,用 0.1mol/L 氯化钠洗涤 ,5无盐水洗脱 ；脱盐浓缩液, 离子交换色层分别；Zerolit FFIP 树脂氯型阴离子交换树脂

7、,00.35M 氯化钠梯度洗脱, 5；浓缩洗脱液, 5Amberlite XAD4树脂脱盐,混合活性部分,浓缩和冷冻干燥；第十四章 氨基糖苷类抗生素1、 离子交换法分别纯化链霉素（强碱）的工艺 发酵液, 12 倍量水稀释, （高价离子在稀溶液中优先吸附）草酸酸化, pH2.8-3.2 ,加热 7075,板框过滤或固体排出式离心分别,冷到 15以下；10% 氢氧化钠中和 pH6.7 7.2,110Na 型树脂吸附 ,得饱和树脂,水洗到澄清,56硫酸洗脱；洗脱液；401 树脂吸附,得饱和树脂,先用无盐水挤压,再以8硫酸单罐循环洗脱34 次；得二次洗脱液,1X14H 型精制, 330OH 型中和；调

8、 pH4.35,0.2-3炭,透光度90以上；小于 35薄膜浓缩,硫酸调pH4.5,加 23活性炭,得酸性脱色液；氢氧化钙调 pH5.5-6,加 1.5 2活性炭到透光度 90以上；无菌过滤,喷雾干燥进风 120135,出风 8485；2、卡那霉素的分别纯化工艺名师归纳总结 （1）硫酸卡那霉素：易溶于水,不溶于乙醇水中加乙醇沉淀,丙酮,苯,醋酸乙酯；第 2 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - （2）分别纯化工艺流程 发酵液, 盐酸调 pH55.5,加水稀释,1X12H 型强酸阳离子树脂吸附,搅拌 4h,用稀盐酸,氯化铵洗涤,无盐水洗到无氯

9、离子；强碱型树脂 201X4 脱色, 22.8氨水洗脱 ,硫酸调 pH3.23.4,乙醇中结晶2h,离心得粗晶 ；95及 50乙醇分次洗涤,无盐水溶解到 20 万 u/ml ,调 pH7,加 15活性炭脱色达滤；精制液,无菌过滤,喷雾干燥,进风 116出风 88,得粉针剂原药；精制液,制成水针剂；3、庆大霉素的分别纯化工艺（1）庆大霉素 ：易溶于水,不溶于乙醇（2）分别纯化工艺流程,丙酮,氯仿,乙醚,苯；发酵液, 盐酸调 pH1.52.5,氢氧化钠中和到 pH6.8 7.2；加水稀释 ；1x2H 型吸附 6h；得饱和树脂；用稀盐酸,氯化铵洗涤,无盐水洗到无氯离子,45氨水洗脱 ；强碱性 201

10、x4 脱色 ；浓缩去氨, 10硫酸调 pH5,加 4活性炭, 40脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风 115,出风 85,得硫酸庆大霉素成品；第十五章 四环类抗生素（两性物质,沉淀法）四环类抗生素的分别纯化沉淀法： 四环类抗生素在碱性下能和钙,镁,钡,某些季铵碱形成复合物而沉淀；一）钙镁1 四环素：发酵液调pH9 ,加 氯化钙形成钙盐沉淀；将 沉淀以草酸溶解,析出草酸钙；过滤,滤液调pH4.6 4.8；析出四环素粗碱；粗碱溶于草酸水,活性炭脱色 2 金霉素：；调 pH4 ,得四环素碱成品；发酵液加 碳酸钙,氯化镁,调 pH7.8 形成沉淀；沉淀用草酸盐酸调 pH1.61.7 溶解；加黄血盐（除铁离

11、子） ,硫酸锌去蛋白；析出；3 土霉素过滤, 加 46盐酸 ,升温 40,金霉素盐酸盐加 0.5-1溴代十六烷吡啶（季铵碱 ）,调 pH9.6-10 ；沉淀析出；沉淀用水洗涤,溶于 4 份体积 5草酸和 1 份体积浓盐酸 ；得到的溶液 pH1 1.2；活性炭脱色；调 pH4 4.5；析出土霉素碱粗品；名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 第十六章 大环内酯类抗生素（弱碱,萃取）1、 性质：无色碱性化合物,微溶于水 ,在水中溶解度随温度上升降低；易溶于醇酮酯（醋酸乙酯,醋酸丁酯） ,氯仿；易溶于酸性水溶液且成盐,盐易溶于

12、水2、 红霉素分别纯化工艺（溶剂萃取法）（1） 单纯溶剂萃取法提取红霉素发酵液预处理：加甲醛 ,硫酸锌,氢氧化钠调pH7.88.2；过滤,滤洗液；萃取： BA（醋酸丁酯）二级逆流萃取,一级 液；反萃取：醋酸缓冲液作二级逆流萃取,一级pH1010.2,二级 pH10.4-10.6 ；一次 BA 萃取 pH5,二级 pH4.6；醋酸缓冲液；萃取： BA 作二级萃取；二次 BA 萃取液；结晶：加 10丙酮, 5静置 2436h；离心,蒸馏水洗涤,得湿晶体；干燥：制颗粒干燥 20h, 7080真空干燥；得红霉素碱成品；（2）溶剂萃取法结合中间盐沉淀的工艺流程发酵液预处理：提取： BA 二次逆流萃取,B

13、A 萃取液；中间盐沉淀：慢慢加入计量的乳酸,加完后连续搅拌30min；得红霉素乳酸盐湿晶体；BA 洗涤, 55干燥；干晶体；搅拌下加入计量的水丙酮液溶解,pH6 左右；氨水或碳酸氢钠调 pH10,搅拌 30min ,55,得红霉素湿晶体；甩滤,水洗到 红霉素碱成品；（3）大孔树脂吸附法的工艺流程pH78,55烘干,得发酵液, 0.1%甲醛, 3硫酸锌,氢氧化钠调 pH7.88.2；过滤；树脂吸附： CAD40 树脂吸附,流速 1/25v/v.min ；树脂洗涤：饱和树脂,40水洗涤；树脂解吸：氨水 pH10,丁酯用 2氨水混合,流速 1/130v/v.min ；丁酯萃取液；反萃取： pH4.7

14、5.2,醋酸缓冲液；BA 萃取：碱化 pH9.810,3840；结晶：加 10丙醇, 5静置 24h 离心过滤洗涤；干燥：湿晶体,制颗粒,70 80干燥；得红霉素碱成品；3、麦迪霉素分别纯化工艺发酵液,草酸酸化 pH2.5-3 ；滤洗液；氢氧化钠调 pH8.5-9, BA 提取二次；得一次 BA 萃取液；盐酸调 pH2-2.5 ,一次酸水提取液；氢氧化钠调 pH8.5-9, BA 提取 2 次；盐酸调 pH2-3.5 ,蒸馏水提取；去残溶剂：减压空气搅拌；结晶： 5%氢氧化钠调 pH8.5-9, 40搅拌 20min；洗涤,干燥：热 pH8.5 无盐水洗涤, 60-70真空干燥,得成品；4、螺

15、旋霉素分别纯化工艺名师归纳总结 发酵液,加硫酸铝,搅拌20min,过滤,得滤液；第 4 页,共 12 页加 15-20BA ,氢氧化钠调pH9,得 BA 萃取液；洗涤：无盐水洗涤BA ；5-10磷酸缓冲液,补加6M 盐酸调 pH2-2.5 ；得磷酸缓冲液；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 除残余 BA 后过滤；结晶： 10M 氢氧化钠调 pH9,升温到 60,保温 20min；得湿晶体；分别去母液；干燥： 70-80真空干燥；得螺旋霉素成品；第十七章 氨基酸类药物的分别纯化1、氨基酸的理化性质（1）物理性质 无色晶体,具特别晶型；易溶于酸碱溶液；在水中

16、溶解度差异大,精氨酸,组氨酸,赖氨酸（都是碱性氨基酸）溶解度最大；胱氨酸,酪氨酸溶解度最小；不溶于有机溶剂,但脯氨酸溶于乙醇；（2）两性解离及等电点 PI（可用等电点沉淀法）带电情形取决于溶液的 pH；pHPI 时,氨基酸带负电；pHPI 时,氨基酸带正电；pHPI 时,溶解度最低,易于沉淀；不同氨基酸PI 各异；同一pH 下各种氨基酸所带电荷的质和量不一样,可应用离子交换法或电泳法分别；2、氨基酸分别纯化实例（给出条件会设计）胱氨酸（1）特性： 六角形片状白色结晶,或结品性粉末,无味,pI4.6 ；难溶于水,不溶于乙醇,乙醚,及其他有机溶剂；易溶于酸碱溶液中,热碱液中易分解；（2）提取和纯化

17、：毛发酸水解,等电点沉淀,盐酸溶解,活性炭脱色,除酪氨酸,结晶；水解：人发或猪毛, 洗净, 2 倍量 10M 盐酸, 预热 70 80,间歇搅拌, 11.5h 内升温到 110,6.57h；过滤,得滤液；中和：用 3040的氢氧化钠中和到pH4.8,连续搅拌15min,复测 pH,放置 36h,过滤得胱氨酸粗品；滤液可分别精氨酸,亮氨酸,谷氨酸初步纯化：取胱氨酸粗品,加 10M 盐酸,加热到 6570,搅拌溶解 30min,加 2活性炭,升温到8590,保温 30min,过滤,滤液加热到 8085,搅拌,用 3040氢氧化钠中和到pH4.8,静置,结晶析出,趁热过滤得沉淀,离心甩干；滤液回收酪

18、氨酸；纯化：取胱氨酸沉淀, 加 1M 盐酸, 加热到 70溶解, 加活性炭, 升温到 85,搅拌 30min 脱色,过滤,得无色透亮澄清滤液；加15 倍蒸馏水,加热到7580,搅拌下用12氨水中和到 pH3.54；胱氨酸结晶析出；过滤得胱氨酸结晶；蒸馏水洗到无氯离子,真空干燥；异亮氨酸名师归纳总结 （1）特性： 无臭,味微苦；pI6.02 ；几乎不溶于乙醇或乙醚；乙醇中形成菱形叶片状或第 5 页,共 12 页（2）片状结晶；溶于热乙醇,25在水中溶解度4.17,7.5为 6.08；制备,分别,纯化- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 菌种培育与发酵：菌种

19、AS1.998 ；种子培育基：葡萄糖,尿素,玉米浆,豆饼水解液,30摇床培育 16h；pH6.5；1000ml 三角瓶装 200ml ；二级种子：另加菜籽油；接种量 3.5,培育 8h；发酵培育基：硫酸铵,豆饼水解液,玉米浆,淀粉水解糖,碳酸钙,pH7.2；3032,通气发酵 60h,2550h 间不断补加尿素,氨水；预处理： 发酵液 10010min,冷却过滤,滤液加硫酸和草酸调pH3.5,过滤除沉淀；离子交换分别：滤液以1.5 树脂量的流速经007X1 （ 732）阳离子交换树脂H型（40X100cm ）,100L 去离子水洗涤,氨水（60, 0.5M 氨水）以 3L/min 流速洗脱,分

20、步收集；合并 pH312 的洗脱液, 7080减压蒸馏浓缩到黏稠状,加去离子水,浓缩,重复三次,以除去氨；脱色,浓缩,结晶：浓缩液加去离子水到原体积的1/4,搅拌匀称, 2M 盐酸调 pH3.5,加1活性炭, 70搅拌 1h,过滤,滤液减压浓缩；105烘干得异亮氨酸粗品；精制： 取异亮氨酸粗品,加浓盐酸,去离子水,加热到2M 氨水调 pH6,5过夜,滤取沉淀,80,搅拌溶解,加氯化钠到饱和,用氢氧化钠调 pH10.5,过滤,滤液用盐酸调 pH6,5过夜,滤取沉淀；沉淀用去离子水加热 80溶解,加氯化钠和 1活性炭, 70搅拌 1h,过滤,滤液减压浓缩；氨水调 pH6,5结晶过夜；滤取结晶,天冬

21、氨酸（酸性氨基酸）105烘干得异亮氨酸粗品；（1）特性： 白色菱形叶片状结晶,pI2.97；溶于水及盐酸,25水中溶解度0.8,75水中为 2.88；不溶于乙醇,乙醚；（2）制备,分别,纯化天冬氨酸酶的制备：大肠杆菌 AS1.881 ,斜面：肉汁培育基；摇瓶：玉米浆,延胡索酸,硫酸镁, 氨水调 pH6；37振荡培育24h；逐级扩大培育； 发酵液用 1M 盐酸调 pH5 ,451h,冷却到室温,离心收集菌体（含天冬氨酸酶）；细胞固定： 湿菌体,悬浮于生理盐水,40保温,加明胶溶液（40, 12）,戊二醛溶液,充分搅拌匀称,5过夜,切成 35mm 的立方小块,浸于戊二醛溶液中过夜；蒸馏水充分洗涤,

22、 滤干得含天冬氨酸酶的固定化细胞；装于填充床式反应器,制成生物反应堆,备用；转化反应： 延胡索酸铵底物液 分别,纯化： 过滤,滤液用37,按肯定流速流过生物反应堆,收集转化液；1M 盐酸调 pH2.8,5结晶过夜；滤取结晶,少量冷水洗涤,抽干, 105干燥得天冬氨酸粗品；粗品用稀氨水溶解成15溶液,加1活性炭, 70搅拌脱色 1h,过滤,滤液用1M 盐酸调 pH2.8,5结晶过夜,滤取结晶,少量冷水洗涤,抽干, 85真空干燥得天冬氨酸精品；谷氨酸分别纯化名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 利用谷氨酸与锌作用,在 pH

23、6.3 条件下生成难溶于水的谷氨酸锌盐沉淀,达到从谷氨酸发酵液中分别谷氨酸的目的；然后,于酸性条件下溶解谷氨酸锌盐,再调至谷氨酸等电点,析出谷氨酸；谷氨酸钙 19238-49-4 的制备方法：由发酵法所得的谷氨酸,与氢氧化钙或碳酸钙中和后 脱色、结晶精制而成；赖氨酸的提取（1）发酵液除菌体及滤液酸化 发酵液中加入絮凝剂絮凝后过滤除菌体,也可用高速离心液固分别设备直接分别出菌 体,回收的菌体可进一步加工利用,澄清的滤液用盐酸调剂 PH4.0 后待用；（2）离子交换提取 赖氨酸的离子交换提取一般用铵型 732树脂 离交终止后,要用水洗柱,以除去可溶性和非可溶性杂质,提高赖氨酸质量,水洗后,用 2-

24、3mol/L 浓度的氨水洗脱, 洗脱高峰赖氨酸含量可达 洗脱,洗脱高峰赖氨酸浓度可达 15-16% 6-8%,如用高浓度氨水 （15-20% ）第十八章 蛋白质的分别纯化（重要）（两性解离）1、蛋白质的提取：蛋白质在不同溶剂中的溶解度,取决于蛋白质分子中非极性疏水基团和极性亲水基团的比例,以及这些基团在蛋白质中相对空间位置；水溶液提取： 蛋白质提取中最常用的溶剂；名师归纳总结 盐浓度：低浓度盐溶液和缓冲液可提高蛋白质在溶液中的稳固性及溶解度；等渗盐溶液,第 7 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 如 0.02-0.05M 磷酸盐缓冲液或0

25、.15M 氯化钠溶液；假如是胞外蛋白质,等渗溶液可削减胞内蛋白质的释放；有些蛋白质在低浓度盐溶液中溶解度低,提高盐浓度,如脱氧核糖核 蛋白, 1M 以上的氯化钠提取；有些蛋白质在盐溶液中溶解度低,用水提取；2、包涵体制备：菌体细胞破裂：如超声波法；包涵体的洗涤和收集：含不同添加剂的磷酸盐缓冲液,离 心收集沉淀；（1） 包涵体溶解前处理：用温顺表面活性剂如TritonX100或低浓度弱变性剂如尿素处理,除去脂质和部分膜蛋白,浓度以不溶解包涵体中表达产物为原就；（2） 包涵体溶解,表达产物变性 包涵体溶解：盐酸胍,尿素 ：破坏离子间相互作用,解除维系蛋白质稳固性的非共价键,引起蛋白质 的去折叠和变

26、性,但不破坏共价键；SDS：破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用；先进行预试验：测定包涵体中表达产物开头溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间；一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为58M,尿素为68M ,SDS 为 12；（3） 重组蛋白的复性：超滤,电渗析除去变性剂；溶液稀释,使变性剂浓度变低,促使蛋白质复性；通过透析,3、 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分别纯化（重要）（pI5.4）分别和纯化,以包涵体的形式表达；（1） 收集菌体细胞：发酵后的工程菌,7000rpm30min ,50mM Tris 盐酸缓冲液反复洗涤,离心三次,去上清；（2） 细胞破裂,包涵体收集：菌体细胞,加 4 倍体积 20m

27、M 磷酸盐缓冲液（含 5mM EDTA ）,冷浴搅匀,超声破裂器中破菌,每次 30s,间隔 30s,反复破裂直到革兰氏镜检无完整的菌体；5000g 离心 30min,去上清,沉淀含包涵体（3）包涵体的洗涤： 沉淀加 9 倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液 （含 0.5% TritonX100 ）,5000g离心 30min,沉淀加9 倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液（含0.5M 脲）同法离心,沉淀加入6倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液（含5mMEDTA ）,10000g 离心 30min ,收集沉淀；（4） 包涵体的变性与复性：沉淀加 8M 脲,振摇 12h,40000g30min ；逐步稀释法将脲浓

28、度稀释到 0.1M ,复性 24h, 17000g30min,上清液为复性粗产品；（5） 色谱纯化：1）疏水色谱PhenylSepharose6FF色谱柱用50mM 磷酸 7硫酸铵（ pH6.9）平稳；复性粗产品加硫酸铵使浓度达7,上样,用50mM 磷酸 7硫酸铵（ pH6.9）,20mM 磷酸盐缓冲液（pH7）,30异丙醇依次洗脱,2）离子交换色谱280nm 紫外检测,收集洗脱峰,电泳检定；装 DEAE SepharoseFF色谱柱, 20mM 磷酸盐缓冲液（ pH6.5）,20mM 磷酸盐 0.15M 氯化钠 （pH6.5）,20mM 磷酸盐 1M 氯化钠 （pH6.4）分别洗脱, 收集洗

29、脱峰, 电泳检定；3）凝胶色谱 装 SephacrylS200 色谱柱, 20mM 磷酸盐 0.15M 氯化钠（ pH6.5）平稳,上样后以相同 缓冲液洗脱, 收集吸取峰, 产品经 0.2um 滤膜过滤； HPLC 检测为单一峰, 纯度 99；SDSPAGE 显示为一条带；4、重组胸腺素 1（pI4.2 ）分别纯化名师归纳总结 （1） 菌体的收集与裂解：离心收集菌体,盐酸胍（7M ,pH7.5） 4搅拌裂解3h,离第 8 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 心收集上清；（2） 透析除盐酸胍：上清液用生理盐水2000ml 透析 24h,中间

30、换一次生理盐水；离心收集上清,用磷酸盐缓冲液（10mM ,pH5.5）2000ml 透析 24h,中间换一次PB；离心收集上清；（3）融合蛋白的纯化：SPSepharoseFF 阳离子柱用 PB（ 10mM ,pH5.5）平稳,上样时收集穿过峰液；DEAE SepharoseFF阴离子柱用上述缓冲液平稳,上样后用 0 0.5M 氯化钠的 PB 梯度洗脱,收集主峰,用水透析除盐,测蛋白浓度,冷冻干燥得融合蛋白；（4） 融合蛋白的裂解： 按蛋白质： CNBr 为 1：3 的比例, 加入到 70的甲酸溶液中混匀,避光室温裂解 24h,加 10 倍体积纯水灭活 CNBr ,橱内充分排风 30min,冷

31、冻干燥；（5） 单体的纯化： SP SepharoseFF阳离子柱用醋酸钠醋酸缓冲液（10mM ,pH5）平稳,冻干样品加缓冲液溶解,4搅拌过夜,离心上清过 SPSepharoseFF 阳离子柱；收集穿过峰液, 冷冻干燥； 用 Tris盐酸缓冲液 （50mM ,pH8）溶解后上QSepharoseFF阴离子柱,用 00.5M 氯化钠溶液梯度洗脱,收集主峰,测定蛋白浓度；HPLC 法检定产品纯度98以上；5、人神经细胞生长因子（pI8.86 ）分别纯化：以人胎盘为原料提取 hNGF；（1）胎盘绒毛的分别：取人胎盘,用注射器向脐带总动脉注入生理盐水,并轻揉胎盘,直到洗尽血污,分别绒毛叶；（2）提取

32、：取来自 100 个胎盘的绒毛叶剪碎,加 20预冷的 PBS（pH6.8,含 1mMEDTA ）；匀浆,每次 3min ,共 3 次；48000rpm30min ；上清以尼龙膜过滤,除去脂肪；滤液中加尿素到 5M,调 pH4 ,静置 2h,以解离 hNGF 高分子聚合体；8000rpm30min ,收集上清；（3）超滤分别：上清液以分子量截留值为 30KD 的超滤膜超滤,滤液再用 10KD 的超滤膜超滤；当截留液剩下 1000ml 时,加 pH4,50mM 醋酸钠醋酸缓冲液 2000ml ,再浓缩到1000ml ,反复 5 次,收集截留液,对平稳缓冲液充分透析；（4） 离子交换色谱纯化：CM5

33、2 离子交换纤维柱,平稳缓冲液平稳,透析液上样,以平稳缓冲液洗脱穿过峰,换用 Tris 盐酸缓冲液（ pH9,50mM ）洗脱,收集洗脱峰（含 hNGF ）；从 100 个胎盘中提取纯化得 hNGF148.6mg ；SDSPAGE 银染显示为单一条带；HPLC 层析得单一峰；6、L 天冬酰胺酶（ pI4.6）分别纯化（1）菌体丙酮粉的制备：天冬酰胺酶为胞内酶；丙酮脱水, 脱脂制成细胞干粉来破坏细胞；（2） 提取：菌体粉悬浮于硼酸硼酸钠缓冲液中（pH8,0.01M ）37搅拌 1.5h,将胞内酶抽提出来,离心,收集上清液；（3） 盐析分别：离心上清液中加硫酸铵使饱和度43,充分沉淀后离心,除去杂

34、蛋白沉淀,上清液中加硫酸铵使饱和度 85以沉淀酶,充分沉淀后离心,收集沉淀；（4） 脱盐：沉淀溶于蒸馏水,利用分子量截留置为10kD 的膜超滤,浓缩到肯定体积后,向浓缩液中加蒸馏水使达到原先的体积,如此反复使透过液中检不出硫酸根离子为止；（5） 沉淀粗酶：浓缩液pH 调到 L 天冬酰胺酶pI 邻近（ pH4.34.5）,加入 2 倍体积冷丙酮使酶沉淀；抽滤收集沉淀,挥尽丙酮,得天冬酰胺酶粗品；（6） 纯化：乙醇分级沉淀：酶粗品溶解,中性条件下加 用醋酸调 pH 到 pI,连续加乙醇沉淀酶；1.1 倍酒精,沉淀除杂蛋白,清液名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 12 页精选学习

35、资料 - - - - - - - - - 第十九章 核酸的分别纯化DNA 和 RNA 都是极性化合物,溶于水,不溶于乙醇,乙醚,氯仿；钠盐比游离酸易溶于水；1、RNA 的提取组织捣碎,制成组织匀浆,用 0.14M 氯化钠提取 ,把细胞质中RNA 蛋白提取出来,留下含DNA 的细胞核物质,调剂pH4.5,沉淀 RNA 蛋白；2、RNA 的分别纯化（1） 氯仿处理：将 RNA 蛋白溶液与等体积的氯仿戊醇（3：1）猛烈振荡,离心,上层 水溶液含 RNA ,蛋白质,下层为氯仿和戊醇；两层之间为变性的蛋白质；上层水相再用氯 仿戊醇混合液处理；并反复数次,到两层之间无蛋白质胶状物为止；也可将 RNA 蛋白

36、溶于碳酸氢钠溶液中,用含少量辛醇的氯仿长时间连续振荡多次,除蛋白 质, RNA 留在水溶液中；溶液中的 RNA 可通过加入2.5 倍量的冷无水乙醇使RNA 以钠盐形式沉淀下来；（2） 苯酚处理法： 90的新蒸馏苯酚提取,冷冻离心,质和 DNA 留在酚层内,需反复多次；RNA 溶于上层水相中,变性蛋白将含 RNA 的水相合并后加入相当于 2.5 倍体积的冷无水乙醇,将 RNA 沉淀出来；制备 RNA 经常加入皂土,以吸附蛋白质和 RNA 酶等杂质,抑制 RNA 酶对 RNA 的降解；加少量 8 羟基喹啉以防止苯酚的氧化；（3）去污剂处理法：用 SDS 等去污剂使蛋白质变性沉淀,然后离心去除沉淀,

37、再用冷乙醇将 RNA 沉淀出来；（4） 盐酸胍处理法：盐酸胍溶液,终浓度 2M ,38,大部分蛋白质溶解,再冷到 0左右, RNA 沉淀出来,离心获得 RNA 沉淀；不能完全去除 RNA 中的蛋白质,需用氯仿处理法进一步除去产品中的蛋白质；（5） 浓盐处理法： RNA 蛋白溶于 10氯化钠溶液中,加热到 乙醇使 RNA 沉淀,或调剂 pH22.5 使 RNA 沉淀；3、DNA 就用 1M 氯化钠提取90,离心除去不溶物,加其次十章 多糖的分别纯化（一般以阴离子形式存在,可离子交换法和季铵盐沉淀法（沉淀用高离子强度的盐溶液溶 解）分别纯化,另外,多糖溶于水,不溶于乙醇,可用水提取,用乙醇沉淀）名

38、师归纳总结 利用离子交换法的洗脱方式：逐步提高盐浓度 （梯度洗脱） ,或分步提高盐浓度 （阶段洗脱） ；第 10 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 生物碱（酸提碱析）例如：苦参粗粉,2%盐酸溶解；过滤,收集（滤液）；NaCl 的目的是（促进目加乙醚,目的是（脱脂,脱色）；加 NaCO3 碱化,用（氯仿）萃取,加的产物进入萃取相）；离子交换法纯化长春碱：离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的富集讨论 通过 D-113、110、D-151、001x7、D-072 、D-062 离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质 碱和长春碱的静态

39、吸附容量、吸附率和解吸率等指标的考察 ,挑选出正确树脂为 D-151. 吸附 :上样溶液浓度为 0.41mg 生药 /mL, pH 为 6.0,流速为 3mL/min; 解吸附 :洗脱剂为 20%乙醇除杂 ,90%乙醇 含 2%氨水 洗脱 . 洛伐他汀羧酸上强碱（阴离子）树脂：洛伐他汀在发酵中以洛伐他汀羧酸形式存在于菌丝体内, 在加入氢氧化钠的碱性条件下可以洛伐他汀酸钠的形式而溶水；依据这一特性 , 以 6mol/L 氢氧化钠调整发酵液 pH11；采纳大孔阴离子交换树脂 D273 作吸附剂 , 洛伐他汀发酵液预处理后树脂吸附,流速 1/30; 解吸采纳添加 4%氢氧化钠的 75%乙醇 , 流速

40、 1/100；离子交换纤维对银杏叶黄酮静态吸附和解吸的讨论：黄酮（酸性）用碱性树脂：名师归纳总结 在静态条件下 ,用强碱性阴离子交换纤维分别纯化银杏叶中的黄酮. 第 11 页,共 12 页正确吸附条件为:溶剂为 20%乙醇溶液 ,黄酮浓度为0.4045 mg/mL, 温度为 70,pH 值为 4; 正确解吸条件为:解吸剂为70%乙醇溶液 ,温度为 70 ,酸度调剂剂为3 mol/L 的盐酸 ,且酸度调剂剂与解吸剂的体积比为14. - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 大孔树脂吸附分别长春花中的文多灵、长春质碱和长春碱：挑选出 AB-8 大孔吸附树脂作为分别长春花生物碱的载体,长春花原料用稀硫酸溶液提取,提取液用氨水调剂pH 值为 8,然后采纳AB-8 大孔吸附树脂柱吸附,用 20%乙醇洗涤除去强极性成分,在 30下用 pH=4 的 50%乙醇解吸,得单吲哚生物碱文多灵和长春质碱,再用 90%乙醇解吸,得双吲哚生物碱长春碱 黄酮类物质沉淀：名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 12 页