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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 纳米抗体为基础的酶联免疫法在甲醇中测定在农产品中黄曲霉毒素的耐性摘要： 噬菌体展现文库NB的重链抗体的重链VHH或纳米抗体的可变结构域,通过免疫羊驼与 黄曲霉毒素 B1AFB 1缀合牛血清白蛋白AFB 1-BSA构建,挑选特定的二黄曲霉毒素 B1 纳米抗体； 与所获得的纳米抗体相比,抗黄曲霉素的单克隆抗体 B5 在有机溶剂和高温下更稳固；特殊是温度高达 95中, M,由于在甲醇中具有高耐受性,通过纳米抗体的基于 ELISA 对样品提取分析未经稀释就直接进行分析；从尖刺花生, 水稻, 玉米和饲料的回收率为 80至 115；总之,别离纳米抗体是中黄
2、曲霉毒素的测定免疫程序的最正确挑选；黄曲霉毒素第一在20 世纪 60 岁月发觉的, 由于的“ 火鸡 X ” ,并且证明是疾病爆发的缘由；黄曲霉毒素是一类自然存在的霉菌毒素,主要是由黄曲霉和黑paraciticus 生产；他们可发生于多种产品,包括粮食,食品和饲料；超过20 种黄曲霉毒素已鉴定,其中,四黄曲霉毒素 B1,B2,G1 和 G2自然发生；黄曲霉毒素B1 是最毒的,且所述一个最有力的致癌性的；它已被列为第一类致癌物；这是对人类致癌,由国际机构癌症争论机构IARC 世界卫生组织 WHO 在 1993.3 确定；黄曲霉毒素 M1 黄曲霉毒素 M1,是黄曲霉毒素B1 的代谢产物羟基化；假如被
3、污染的食物或饲料被吞入,它可以是在哺乳动物尿液和牛奶中发觉； AFM1 污染物可发生在商业奶及奶制品,从而成为潜在的健康危害给人类；由于高毒性的黄曲霉毒素和致癌性,在食品和农业产品,对于黄曲霉毒素 B1 或总黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1,B2,G1 和 G2检测,很多国家都建立了严格的最大答应限度,变化范畴的 2 至 20 微克公斤；在食品安全的担忧和官方立法方面,精确而灵敏的测定黄曲霉毒素成为一个重要的需要；各种各样的分析方法可黄曲霉毒素测定,从精确的分析以快速方式例如,高效液相色谱串联质谱 黄曲霉毒素特异性抗体不仅需要像spectrometry6例如, imunochromatographi
4、c assay7 ；immunoassays免疫测定的方法,同时也用仪器筛查方法检测用于免疫亲和纯化,它是一个标准的清理过程；在过去的几十年里,很多的抗黄曲霉毒素已经开发了通过polyclonal 多克隆和monoclonal 单克隆技术 应用于各种测定法；随着时代的进展分子工程和外表展现技术,抗 体生产已经从传统的抗体移动到的重组抗体；黄曲霉毒素特异性重组抗体例如 Fab 和 scFv抗体已经被开发并利用酶联免疫吸附和生物传感器方面；然而,由于这些抗体的低表达产率和稳固性片段, 该应用该技术的结果是有问题的；骆驼产生抗体的特殊的子类这自然缺乏轻链,称为重链 antibody.；重链的抗原结合
5、位点抗体是由重的可变结构域单独形成,这些 VHHs链 VHH 重新组合表达可产生单域重链抗体,也称为VHH 抗体或纳米抗体；与传统的相比,纳米抗体进展是更简单重组抗体；例如,一个相对小型文库够实现抗原特异性结合剂,只有一对引物是足够的,以放大整个纳米抗体的基因从而表达产率较高,在培育基可达 30毫克的 L-1；纳米抗体片段具有亲水性残基取代框架二个区域, 从而更可溶比起常规抗体片段；由于它们的单结构域性质,在高温顺有机溶剂环境当中,纳米抗体也被证明是更稳固；有了这些好处,纳米抗体在下一代免疫当中是有很好的进展前景；由于其良好的性能,纳米抗体技术有被广泛地应用于诊断和治疗领域；一越来越多的纳米抗
6、体的已单独别离出小分子应用于更多的免疫测定当中；纳米抗体的报道,除了中国出版评判的两个洗脱效率但是,没有对黄曲霉毒素特异性 在非免疫噬菌体生物淘洗方法显示的VHH 图库对 AFB1-BSA 的报道,另一份报告是有关抗特殊型的黄曲霉毒素的纳米抗体从抗黄曲霉毒素隔离出来的通过单克隆抗体免疫VHH 库,这些纳米抗体识别该单克隆的抗原决名师归纳总结 定簇抗体和可被用作替代物的黄曲霉毒素的半抗原如涂层抗原；免疫文库更直接导致纳米抗第 1 页,共 5 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 体具有较高的亲和力；在本争论中, 我们的目标是从免疫噬菌体显示库别离针对黄曲霉
7、毒素 纳米抗体来；我们也有爱好在评估其物理化学性质,并将其与比照单克隆抗体,如耐热性,耐溶剂的成效影响；试验部分材料与试剂 ；全部试剂均为分析纯级,除非另有规定； Antiaflatoxin单克隆抗体 mAbB5 产生于我们的试验室；黄曲霉毒素 B1 ,B2,G1, G2,M1标准,牛血清白蛋白BSA,聚乙二醇 8000 PEG8000,弗氏不完全佐剂,3,3 ,5,5 - 四甲基联苯胺TMB和山羊抗鼠单克隆抗体偶联至辣根过氧化物酶美国；HRP购自 Sigma圣路易斯,密苏里州获得大肠杆菌 ER2738的感受态细胞,大肠杆菌 ER2736专线 Lucigen 公司购米德尔顿, WI,USA,顶
8、 10F 感受态细胞是自 Life Technologies格兰德岛,纽约州购得；小鼠抗 M13单克隆抗体辣根过氧化物酶HRP是购自 GE Healthcare 新泽西州 Piscataway ,USA；辣根过氧化物酶标记的抗 HA标签的鼠标单克隆抗体购自康运生物购北京, 中国；帮助噬菌体 M13KO7和 SfiI 位分别为自 New England Biolabs伊普斯维奇,MA,USA获得；吐温 20 是由百灵威科技北京,中国获得；xTractor缓冲蛋白提取和His60 超流树脂被自Clontech Laboratories公司购山景,CA,USA； QIAprep 离心小量制备试剂盒,
9、QIAquick 凝胶提取试剂盒和QIA 快速 PCR纯化套件均来自Qiagen 公司；LeukoLOCK总 RNA别离系统自 Applied Biosystems福斯特城得到 CA中； 12H2O,0.2 克 KH 2 PO 4 和 0.2g 的氯化钾在 1000 毫升去离子水； pComb3X噬菌体载体是从卡洛斯F. 巴尔巴斯博士斯克里普斯一份厚礼争论所,拉霍亚,CA；安全 ；纯黄曲霉毒素标准的物被处理 要极为谨慎；全部进来的接触项目的黄曲霉毒素,噬菌体和细菌培育物玻璃器皿,小瓶,试管, ELISA 板等他们被丢弃或高压灭菌前 1-2小时,浸渍在的 10漂白溶液中；羊驼免疫 ；一个 2 岁
10、的雄性羊驼是皮下接种 200 微克黄曲霉毒素 B1-BSA和具有相同体积的弗氏不完全佐剂；以下注射是在 10 周的时间内每 2 个星期进行一次；免疫前收集血清作为阴性对比；收集 1 周后的第三,第四,第五和第六的十毫升血液,进行试验滴度和隔离白细胞；噬菌体展现文库的构建；依据本滴度的结果,在第五血液被挑选来提取 RNA,并构建文库；该库是依据构建金等；简言之, RNA从血液中提取并转录为 cDNA；来自 IgG2 和 IgG3 的纳米抗体基因片段通过 PCR扩增,利用两种不同的 SfiI 位点引物下划线 ,正向引物VHH-FCAT GCC ATG ACT GTG CAG GCC GCG GCC
11、 CAG KTG CAGCTC GTG GAG TC框架 1 区,反向引物 VHH-R1CAT GCC ATG ACT CGC GGC CGG CCT GGC CGT CTT GTG GTT TTG GTG TCT TGG G和 VHH-R2CAT GCC ATG ACT CGC GGC CGG CCT GGC CAT GGG GGT CTT CGC TGT GGT GCG分别对应于所述的IgG2 和 IgG3 铰链区； PCR产物和 pComb3x 噬菌粒载体分别消化具有 SfiI 位和 随后连接生成 pComb3x/纳米抗体构建；转入大肠杆菌ER2738后,通过电镀在 LB 氨苄青霉素琼脂
12、平板上估量库大小；通过的对 LB-Amp平板评判库的多样性,从而二十克隆被挑选；文库淘选； 在 96 孔微量滴定板库进行四轮的洗涤；在 1,2,3 和 4 圆孔中,抗原 AFB1-BSA 涂布为 1,0.25 ,0.1 和 0.05 微克；每一淘洗轮使用三个重复；为了排除非特异性结合,三名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 5 页精选学习资料 - - - - - - - - - 个孔重复都用3BSA的预吸附包衣； 150 微升库包被的BSA加入到各孔中在室温RT孵育 1 小时；然后将上清液转移到涂有抗原的孔中,并温育2 小时室温,随后用0.05 PBST 10 次洗涤 ；黄曲
13、霉毒素标准被用于竞争性洗脱结合的噬菌体；在10的 100 L 甲醇 -PBS用作洗脱缓冲液对50,10,2 和 1ng 的黄曲霉毒素分别洗脱 ；在 RT 下温顺进行洗脱振摇30 分钟；在每一轮两微升的洗脱溶液用于测试的噬菌体滴度,这被称为 输出滴度 ,剩余部分放大为下面淘洗；用于淘洗的再扩增噬菌体的滴度也被测试,将其称为 输入滴度；水溶性纳米抗体的表达和纯化 来自特殊的阳性克隆噬菌粒在非抑制的大肠杆菌 TOP10F细胞转化并表达； 对于表达, 通过 37 250 转振荡培育条件下,100 毫升的 SB培育基过夜培养, TOP10F 细胞携带纳米抗体的表达质粒；当培育物到达 0.6-0.8 的
14、OD 600 值,加入 1 毫摩尔异丙基-D-1- 硫代半乳糖苷 IPTG,接着连续振摇过夜；依据制造商的说明书,通过用 xTractor 缓冲蛋白质得到别离；依据制造商的指示,用的 Ni-NTA 金属亲和层析将含有6xHis 标签纳米抗体被纯化；依据标准,纯度和尺寸纳米抗体用15复原 SDS-PAGE进行测定,随后用考马斯亮蓝染色；纳米抗体的浓度为用Bradford方法测定；样品制备 ；将 5 克花生, 水稻,玉米和饲料用分别称重,并用含有2BSA的 70甲醇 / PBS超声波 5 分钟提取； 然后将混合物过滤两次,并在 5000g 离心 10 分钟 ; 将上清液直接用于样品分析；结果与争论
15、特异性黄曲霉毒素噬菌体克隆的挑选； 107 个独立的克隆； 为了获得高的比抗黄曲霉毒素噬菌体克隆, 我们利用所述淘洗策略通过增加挑选压力；四次淘洗循环进行以降低包被抗原浓度和游离 AFB1在每一轮竞争性洗脱表 1；为了尽量削减非特异性结合,仍进行有力的清洗步骤和预吸附；从表 1 中,在每一轮中噬菌体输出滴度将会增加,这说明在淘洗中特定的噬菌体克隆进行富集； 从第四输出滴定板中的三十个克隆的随机挑选,并通过噬菌体 ELISA 检测； 二十八克隆显示通过自由 AFB1包被抗原结合到一个抑制剂；阳性克隆的质粒提取和测序结果说明有两种特殊克隆,通过被选定命名为 Nb26 和 Nb28；从图 1 中 两
16、个克隆都是长铰链 VHHsIgG2 并且框架区是高度保守的；在 FR2 中两者都包含替换特点,包括在位置 37,44,45,和 47 的 F,E,R和 F / G,这也说明了纳米抗体的溶解度两个克隆具有相同的 CDR1区,并且只有七个氨基酸在 CDR2和 CDR3区域是唯独的； 这可能说明, 两种抗体均来自从相同的B细胞和相像的方式绑定黄曲霉毒素；表噬菌体展现纳米抗体的一挑选附表表 1 对准选定的纳米抗体 Nb26 和 Nb28的氨基酸序列；在相同的位置已被指出,只有一个唯独的氨基酸残基与上面的Nb26不同,点被用于指示残留标识顶端序列；纳米抗体 FR2的实线框勾画的特点是氨基酸取代；经过 4
17、 轮挑选,第四输出滴定板的 30 个克隆被挑选,并在 3mL SB的扩增培育；过夜培养后,将培育液离心在 3000g,20 分钟,通过噬菌体酶联免疫吸附测定ELISA将上清液再进行其特性；克隆结合的是 性；AFB 1-BSA,而不是 BSA,分别视为阳性并挑选用于进一步特可溶性纳米抗体的纯化和表达；对于表达,这两个特殊的纳米抗体质粒,分别转化到 TOP10F,这是一种非抑制大肠杆菌菌株,在没有 pIII 的蛋白质中,可以答应水溶性纳米抗体的表达；通过纯化上 Ni-NTA 亲和柱,被 6 0.6 毫克 / 升纯化的产率表示为装置具有三个独立试验的数 标准名师归纳总结 图 2； 竞争性结合曲线与特
18、定的纳米抗体克隆；示出的纳米抗体Nb26 和 Nb28 第 3 页,共 5 页随着自由 AFB1增加量结合 AFB1-BSA的抑制代表曲线；每个点代表三次重复的平均值；该- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 中所用的包被抗原纯化的纳米抗体的浓度检测分别为是1-0.1 和 1-0.02微克 / 毫升 Nb26和Nb28；插图显示的是 15的凝胶上 SDS-PAGE分析纳米抗体 Nb26 和 Nb28 的纯化；图 3；基于 ELISA 试验对 Nb26 A和 Nb28B纳米抗体的的交叉反应对黄曲霉毒素 B1 ,B2 ,G1 , G2 和 M1 ； 每个结果表示
19、为三次重复的平均值 标准偏差；在 96 孔板中涂有 1 微克 / 毫升 AFB 1 的半抗原 -BSA 缀合物；用相等的量纳米抗体,在 PBS中进行 AFB 1 的连续稀释并且测试化合物；100 微升体积 混合物加入到孔中；结合纳米抗体是用非常之一 000 稀释的 HRP偶联的抗 HA标签单克隆抗体检测表 2 AFT 化合物 CR竞争 ELISA 试验与纳米抗体 Nb26和 Nb28 交叉反应图 4 中的特定黄曲霉毒素 B1 纳米抗体 Nb26 ,Nb28 和单克隆抗体 B5 耐热性；纳米抗体与常规的单克隆抗体到 PBS中稀释浓度,并在 20,50,65,75 和 95不同温度下进行 5 分钟
20、 A或在 85下, 0,5, 15,25,35,45 和 60 分钟 B不同的时间中加热；然后重新equilibated至 RT,其结合至涂覆的AFB 1-BSA 在微量滴定板进行测定；数值是三次以及重复试验的平均值 标准偏差图 5 为基础的 ELISA 法,纳米抗体 Nb26,Nb28 和单克隆抗体在甲醇A,二甲基亚砜 B,二甲基甲酰胺C,丙酮 D和乙腈五 B5 性能影响；含有 10, 20, 40, 60和 80不同浓度的有机溶剂的PBS缓冲液,分别用来按序列稀释自由黄曲霉毒素；在连续稀释液中混合等体积的纳米抗体 Nb26,Nb28或 mAb B5,然后 100 L 混合物 加入到孔中；通
21、过加入缀合的抗 HA-标记的 mAb的纳米抗体 HRP100 L在 1/10000PBS 稀释和羊抗鼠多克隆结合有 HRP的单克隆抗体 B5 1/5000PBS 稀释 分别检测结合的免疫试剂；值是平均值 3 次重复的标准偏差；纳米抗体酶联免疫吸附 温度的稳固性 别离的纳米抗体的热稳固性的特点是通过与抗黄曲霉毒 B1 单克隆抗体与我们试验室指定的 B5进行比照； Nb26和 Nb28中的抗体溶液在 PBS中制备；该 溶液,在 20,50,65,75 和 95下温育 5 分钟 在 thermocontrolled 水浴；后重新平稳至室温,各样品的直接结合到涂覆 AFB 1-BSA 的微孔板中进行测
22、试；从图 4A 中,人们发觉,单克隆抗体 B5 通过提高温度而逐步失去结合才能然而纳米抗体在温度为高从图4A 中,人们发觉,单克隆抗体 B5 通过提高温度而逐步失去结合才能然而纳米抗体在温度为高达 95时仍旧可以与抗原结合；为了进一步证明这一点,纳米抗体 Nb26,Nb28 和 mAb B5 被加热到 85,加热的时间分别为0,5,15,25,35, 45,60 分钟图 4B；纳米抗体 Nb26和 Nb28 在 85下 孵育 1 小时后, 它们的结合活性分别保留约 在培育 15 分钟丢失；70和 40,然而, 单克隆抗体的结合活性溶剂效应 具有高的耐有机溶剂的抗体在真实样品的分析是优选的,特殊
23、是对亲脂性的分析物；中黄曲霉毒素的情形下,它是高度亲脂性,使用的有机溶剂,如 甲醇和乙腈,在提取过程中是必要的；当基体效应可以忽视不计时微量稀释能够满意分析时的要求；在这项研究中,在甲醇,二甲亚砜DMSO中,二甲基甲酰胺DMF,丙酮和乙腈的浓度从 10至80的存在下,我们调查了下纳米抗体以及单克隆抗体 B5 的性能；纳米抗体 Nb26,Nb28和 mAb B5稀释在各溶液中,并最终抗体暴露于在从 540 浓度的有机溶剂中 ; 这些结合才能的抗体与抗原随后被测试图5；在一般情形下,增加的溶剂中的浓度引起最大的信号减小 ; 然而,纳米抗体呈更好的耐性对于大多数试剂；在 80甲醇中, Nb26和 N
24、b28保持其结合才能为 100, 而单克隆抗体 B5 在其中 50都失去其活性； 类似的结果在用丙酮和乙腈中都可以观看到；与此相反,在单克隆抗体和mAB中, DMSO和 DMF这两个有显著和类似的成效；这个属性有利于亲和柱的进展,在甲醇,丙酮或乙腈中提取样品不需要高度稀释; 不过,这个属性是不是可用的在DMSO或 DMF中提取的样品；名师归纳总结 利用的纳米抗体为基础的ELISA 分析样品要应用的纳米抗体为基础的ELISA 法进行检测第 4 页,共 5 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 样品的分析,用花生,水稻,玉米和饲料作为代表性样品对基体效应进行
25、评判；甲醇是在黄曲霉毒素分析中最常用的提取溶剂；纳米抗体的基于ELISA 法能甲醇浓度高达70下工作,在不同浓度的甲醇构成的标准曲线相对于所述最大OD值和 IC 50 进行比较 . ；从图 6 中,用甲醇浓度的增加,最大OD值增加但是灵敏度降低,其IC50 值约 3 毫微克 / 毫升；假如基体效应可以忽视不计,将样品提取物可不用稀释直接进行分析；从我们以往的争论,BSA 可以充当稳固剂该试验中排除基体效应；在这项争论中,2BSA的 70甲醇 /PBS 并加有了一系列的 之间没有显著差异曲线的变化；AFB1浓度来提取样品； 从图 7 中的基体曲线与标准Nb26 和 Nb28 纳米抗体为基础的测定
26、法的线性范畴分别为是 2.468- 268.59 微克 / 千克和 3.185-211.24 微克 / 千克,目前其适合于大多数国家的在监管限制5.0 微克 / 千克来监测黄曲霉毒素 AFB 1 浓度；回收和复性分析是与绽开的纳米抗体 Nb26 基于 ELISA 试验去验证该测定；在试验前,每个样品被证明含有少于0.1 毫微克 / 毫升的黄曲霉毒素通过高效液相色谱法 HPLC；总回收率为 80. 115的样品加标黄曲霉毒素 B1表 3；结论 在这项争论中,两个特定黄曲霉毒素性纳米抗体被别离的 和定性；在有机溶剂采纳纳米抗体的检测表现出较好的热稳固性和更高耐受性；纳米抗体的高的热稳固性使得它们成
27、为 免疫分析的进展中具有有吸引力,不仅有了较长的保质期,也有利于上 遇到恶劣环境也能实地测试； 纳米抗体的这种特性通常是与 CDR1和 CDR3之间的二硫键相关；虽然, 两个纳米抗体别离在本争论中没有形成一个跨 CDR二硫键,但仍显示出高的热稳固性；这说明,纳米抗体的热稳固性也可以这样说明,它有绽开后适当地重新折叠的才能；除了温度稳固性,通过与黄曲霉素特异性单克隆抗体B5 进行比较,纳米抗体仍表现出对甲醇,丙酮和乙腈更高耐受性；样品分析可以不经稀释,直接的来进行提取,在 70的甲醇浓度萃取溶液, ,在 35的浓度的甲醇样品试验最终测定的；这些特性在纳米抗体的应用中大幅提升；例如,纳米抗体可以用
28、于在具有较高的固定化密度生物传感器,也可于用需要较少稀释,以及在高温环境下于亲合层析；图 6； 基于 ELISA 纳米抗体的Nb26A和 Nb28 B在甲醇中的性能性影响；含在不同的名师归纳总结 浓度 10, 20, 40, 60,和 70甲醇的 PBS缓冲液,分别用来使自由AFB 1 的连续第 5 页,共 5 页稀释在连续稀释的纳米抗体Nb26和 Nb28 等体积的混合,然后将混合物加入100 L 加入到孔中；通过加入HRP100 L 的缀合的抗HA-标记的 mAb的纳米抗体在PBS中的 1/10000 稀释可以检测结合的免疫试剂；值是平均值 标准差三个孔重复；图 7 测定纳米抗体Nb26A和 Nb28B在 70甲醇 -PBS ,稻 ,玉米 ,花生 和饲料 的基体效应的标准曲线；分析化学第8878 DX；- - - - - - -