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1、生物工程与下游技术知识点整理第十三章内酰胺类抗生素1、 （掌握青霉素的性质并分析流程，会设计提取分离纯化的流程）青霉素的理化性质（1）酸碱性：有一个酸性基团；解离常数pK 值为2.7；（2）溶解度：青霉素是有机酸，易溶于醇，酸，醚，酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小，迅速丧失抗菌能力；青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇，丁醇，酮类，醋酸乙酯；含有少量水分时，溶解度大大增加；不溶于乙醚，氯仿，醋酸戊酯；青霉素的分离纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本 277 页发酵液，冷到10下，1/3 体积中性过滤，板框压滤或鼓式过滤，10硫酸调pH5，加 PPB 溶液（十五
2、烷基溴化吡啶，絮凝剂），板框过滤或鼓式过滤，冲水量 2030；滤洗液；加 1/3BA （醋酸丁酯） ，加 PPB，10硫酸调pH22.5，逆流萃取；得一次丁酯萃取液；加 0.3活性炭搅拌10min ，压滤，10冷冻脱水，水分在0.9%以下，过滤得BA 清液；加温到 15，加醋酸钾乙醇溶液适当搅拌，结晶后静置1h 以下，甩滤，得湿晶体；湿晶体放洗涤罐，丁醇（4 6L/10 亿）洗涤，乙酸乙酯（2L/10 亿）顶洗，挖出粉子真空干燥；得青霉素G 钾盐成品；2、头孢菌素C （1）头孢菌素C 性质： 为两性化合物，C 为氨基酸，水溶性很大，稳定性差；大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离头C，离子交换法纯化
3、，络盐 沉淀法 结晶；（2）分离纯化工艺流程头 C 发酵液，硫酸酸化，板框过滤，得头C 滤液；大孔网状吸附剂吸附，得饱和树脂；丙酮水溶液解吸，得一次头C 解吸液；阴离子树脂吸附，醋酸钠解吸；加醋酸锌，得头C 锌络盐结晶；板框过滤，得头C 锌盐湿品；气流干燥，得头C 锌盐成品；（3）头 C 分离纯化工艺要点A、发酵液预处理发酵液冷到15以下， 硫酸酸化到pH2.5 3， 放置一段时间； 板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣；收集，合并滤液，洗液，低温10保存；B、 大孔网状吸附剂的吸附和解吸头 C 最适吸附pH2.5 3，XAD4 的吸附容量为1520g/L；24 倍体积去离子水洗涤，除去硫
4、酸根等阴离子，以免干扰离子交换树脂的纯化；1525乙醇，丙酮，或异丙醇水溶液来解吸。C、离子交换树脂的纯化采用 弱碱性阴离子交换树脂，树脂用醋酸溶液处理成醋酸型，开始吸附；去离子水洗涤树脂，1.52.5醋酸钠（钾）水溶液解吸；D、沉淀结晶精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 12 页头 C 可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni 形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍 ；头 C 锌盐，淡黄色微晶粉末，不溶于水及氯仿，甲醇，乙醇；离子交换解吸液，放结晶罐中，5 ，加醋酸锌 ，搅拌溶解，加结晶液体积30的乙醇或丙酮，析出头C 锌盐微晶沉淀；
5、选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头C 溶液；E、膜分离发酵液通过 微孔滤膜MF ，除去菌丝，固形物；超滤 UF （除大分子物质） ，除去分子量10000 以上的蛋白质，多糖，深棕色色素，获得色浅的头 C 滤液；反渗透膜 RO 浓缩（ 除水 ）3、克拉维酸的分离纯化（1）萃取：溶剂萃取法发酵滤液， 盐酸调 pH2，3/4 体积 正丁醇，多级逆流萃取，5萃取；1/20 体积水，用20氢氧化钠水溶液调pH7；液液离心机，水相反抽提液；浓缩洗脱液，5Zerolit FFIP 氯型阴离子交换树脂，0 0.35M 氯化钠梯度吸脱，合并活性部分，减压浓缩；Amberlite XA
6、D4树脂脱盐，能吸附克拉维酸，不吸附无机盐； 1正丁醇或无盐水洗脱，混合活性部分，真空浓缩和冷冻干燥；（2） 离子交换：吸附于强碱性阴离子交换树脂上，用含盐水溶液洗脱；发酵滤液， pH6.2， 通过 Zerolit FFIP 氯型强碱性阴离子交换树脂，冷的 1mol/L 氯化钠洗脱；浓缩液， pH6，25的滤液， 通过 Amberlite XAD4树脂 ，用 0.1mol/L 氯化钠洗涤 ，5无盐水洗脱 ；脱盐浓缩液， 离子交换色层分离；Zerolit FFIP 树脂氯型阴离子交换树脂，00.35M 氯化钠梯度洗脱， 5；浓缩洗脱液，5Amberlite XAD4树脂脱盐，混合活性部分，浓缩和
7、冷冻干燥。第十四章氨基糖苷类抗生素1、 离子交换法分离纯化链霉素（强碱）的工艺发酵液， 12 倍量水稀释， （高价离子在稀溶液中优先吸附）草酸酸化， pH2.8-3.2 ，加热 7075，板框过滤或固体排出式离心分离，冷到 15以下；10% 氢氧化钠中和pH6.7 7.2，110Na 型树脂吸附 ，得饱和树脂，水洗到澄清，56硫酸洗脱；洗脱液；401 树脂吸附，得饱和树脂，先用无盐水挤压，再以8硫酸单罐循环洗脱34 次；得二次洗脱液，1X14H 型精制， 330OH 型中和；调 pH4.35，0.2-3炭，透光度90以上；小于 35薄膜浓缩，硫酸调pH4.5，加 23活性炭，得酸性脱色液；氢氧
8、化钙调pH5.5-6，加 1.5 2活性炭到透光度90以上；无菌过滤，喷雾干燥进风120135，出风8485；2、卡那霉素的分离纯化工艺（1）硫酸卡那霉素：易溶于水，不溶于乙醇(水中加乙醇沉淀)，丙酮，苯，醋酸乙酯；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 12 页（2）分离纯化工艺流程发酵液， 盐酸调 pH55.5，加水稀释，1X12H 型强酸阳离子树脂吸附，搅拌 4h，用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子；强碱型树脂201X4 脱色， 22.8氨水洗脱 ，硫酸调 pH3.23.4，乙醇中结晶2h，离心得粗晶；95及 50乙
9、醇分次洗涤，无盐水溶解到20 万 u/ml，调 pH7，加 15活性炭脱色达滤；精制液，无菌过滤，喷雾干燥，进风116出风 88，得粉针剂原药；精制液，制成水针剂；3、庆大霉素的分离纯化工艺（1）庆大霉素 ：易溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿，乙醚，苯；（2）分离纯化工艺流程发酵液， 盐酸调 pH1.52.5，氢氧化钠中和到pH6.8 7.2；加水稀释 ；1x2H 型吸附 6h；得饱和树脂；用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子，45氨水洗脱 ；强碱性 201x4 脱色 ；浓缩去氨，10硫酸调pH5，加 4活性炭， 40脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风115，出风 85，得硫酸庆大霉素成品；第十
10、五章四环类抗生素（两性物质，沉淀法）四环类抗生素的分离纯化沉淀法： 四环类抗生素在碱性下能和钙，镁，钡，某些季铵碱形成复合物而沉淀；一）钙镁1 四环素：发酵液调pH9，加 氯化钙形成钙盐沉淀；将 沉淀以草酸溶解，析出草酸钙；过滤，滤液调pH4.6 4.8；析出四环素粗碱；粗碱溶于草酸水，活性炭脱色；调 pH4，得四环素碱成品；2 金霉素：发酵液加 碳酸钙，氯化镁，调 pH7.8 形成沉淀；沉淀用草酸盐酸调pH1.61.7 溶解；加黄血盐（除铁离子） ，硫酸锌去蛋白；过滤， 加 46盐酸 ，升温 40，金霉素盐酸盐析出；3 土霉素加 0.5-1溴代十六烷吡啶（季铵碱 ） ，调 pH9.6-10
11、；沉淀析出；沉淀用水洗涤，溶于 4 份体积 5草酸和1 份体积浓盐酸；得到的溶液pH1 1.2；活性炭脱色；调 pH4 4.5；析出土霉素碱粗品；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 12 页第十六章大环内酯类抗生素（弱碱，萃取）1、 性质：无色碱性化合物，微溶于水 ，在水中溶解度随温度升高降低；易溶于醇酮酯（醋酸乙酯，醋酸丁酯） ，氯仿；易溶于酸性水溶液且成盐，盐易溶于水2、 红霉素分离纯化工艺（溶剂萃取法）（1） 单纯溶剂萃取法提取红霉素发酵液预处理：加甲醛 ，硫酸锌，氢氧化钠调pH7.88.2；过滤，滤洗液；萃取： BA
12、（醋酸丁酯）二级逆流萃取，一级pH1010.2，二级 pH10.4-10.6 ；一次 BA 萃取液；反萃取：醋酸缓冲液作二级逆流萃取，一级pH5，二级 pH4.6；醋酸缓冲液；萃取： BA 作二级萃取；二次BA 萃取液；结晶：加10丙酮， 5静置 2436h；离心，蒸馏水洗涤，得湿晶体；干燥：制颗粒干燥20h， 7080真空干燥；得红霉素碱成品；（2）溶剂萃取法结合中间盐沉淀的工艺流程发酵液预处理：提取： BA 二次逆流萃取，BA 萃取液；中间盐沉淀：缓缓加入计量的乳酸，加完后继续搅拌30min；得红霉素乳酸盐湿晶体；BA 洗涤， 55干燥；干晶体；搅拌下加入计量的水丙酮液溶解，pH6 左右；
13、氨水或碳酸氢钠调 pH10，搅拌 30min ，55，得红霉素湿晶体；甩滤，水洗到pH78，55烘干，得红霉素碱成品；（3）大孔树脂吸附法的工艺流程发酵液， 0.1%甲醛， 3硫酸锌，氢氧化钠调pH7.88.2；过滤；树脂吸附： CAD40 树脂吸附，流速1/25v/v.min ；树脂洗涤：饱和树脂，40水洗涤；树脂解吸：氨水pH10，丁酯用2氨水混合，流速1/130v/v.min ；丁酯萃取液；反萃取： pH4.75.2，醋酸缓冲液；BA 萃取：碱化pH9.810，3840；结晶：加 10丙醇， 5静置 24h 离心过滤洗涤；干燥：湿晶体，制颗粒，70 80干燥；得红霉素碱成品；3、麦迪霉素
14、分离纯化工艺发酵液，草酸酸化pH2.5-3；滤洗液；氢氧化钠调pH8.5-9， BA 提取二次；得一次BA 萃取液；盐酸调 pH2-2.5，一次酸水提取液；氢氧化钠调pH8.5-9， BA 提取 2 次；盐酸调 pH2-3.5，蒸馏水提取；去残溶剂：减压空气搅拌；结晶： 5%氢氧化钠调pH8.5-9， 40搅拌 20min；洗涤，干燥：热pH8.5 无盐水洗涤，60-70真空干燥，得成品；4、螺旋霉素分离纯化工艺发酵液，加硫酸铝，搅拌20min，过滤，得滤液；加 15-20BA，氢氧化钠调pH9，得 BA 萃取液；洗涤：无盐水洗涤BA ；5-10磷酸缓冲液，补加6M 盐酸调 pH2-2.5；得
15、磷酸缓冲液；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 12 页除残余 BA 后过滤；结晶： 10M 氢氧化钠调pH9，升温到 60，保温 20min；得湿晶体；分离去母液；干燥： 70-80真空干燥；得螺旋霉素成品；第十七章氨基酸类药物的分离纯化1、氨基酸的理化性质（1）物理性质无色晶体，具特殊晶型；易溶于酸碱溶液；在水中溶解度差异大，精氨酸，组氨酸，赖氨酸（都是碱性氨基酸）溶解度最大；胱氨酸，酪氨酸溶解度最小；不溶于有机溶剂，但脯氨酸溶于乙醇；（2）两性解离及等电点PI（可用等电点沉淀法）带电情况取决于溶液的pH；pHPI 时，
16、氨基酸带负电；pHPI 时，氨基酸带正电；pHPI 时，溶解度最低，易于沉淀；不同氨基酸PI 各异；同一pH 下各种氨基酸所带电荷的质和量不一致，可应用离子交换法或电泳法分离；2、氨基酸分离纯化实例（给出条件会设计）胱氨酸（1）特性： 六角形片状白色结晶，或结品性粉末，无味，pI4.6；难溶于水，不溶于乙醇，乙醚，及其他有机溶剂；易溶于酸碱溶液中，热碱液中易分解；（2）提取和纯化：毛发酸水解，等电点沉淀，盐酸溶解，活性炭脱色，除酪氨酸，结晶；水解：人发或猪毛， 洗净， 2倍量 10M 盐酸， 预热 70 80，间歇搅拌， 11.5h 内升温到110，6.57h；过滤，得滤液；中和：用 3040
17、的氢氧化钠中和到pH4.8，继续搅拌15min，复测 pH，放置36h，过滤得胱氨酸粗品；滤液可分离精氨酸，亮氨酸，谷氨酸初步纯化：取胱氨酸粗品，加10M 盐酸，加热到6570，搅拌溶解30min，加 2活性炭，升温到8590，保温30min，过滤，滤液加热到8085，搅拌，用3040氢氧化钠中和到pH4.8，静置，结晶析出，趁热过滤得沉淀，离心甩干；滤液回收酪氨酸；纯化：取胱氨酸沉淀， 加 1M 盐酸， 加热到 70溶解， 加活性炭， 升温到 85，搅拌 30min 脱色，过滤，得无色透明澄清滤液；加15 倍蒸馏水，加热到7580，搅拌下用12氨水中和到 pH3.54；胱氨酸结晶析出；过滤得
18、胱氨酸结晶；蒸馏水洗到无氯离子，真空干燥；异亮氨酸（1）特性： 无臭，味微苦；pI6.02 ；几乎不溶于乙醇或乙醚；乙醇中形成菱形叶片状或片状结晶；溶于热乙醇，25在水中溶解度4.17，7.5为 6.08；（2）制备，分离，纯化精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 12 页菌种培养与发酵：菌种 AS1.998；种子培养基：葡萄糖，尿素，玉米浆，豆饼水解液，pH6.5；1000ml 三角瓶装200ml ；30摇床培养16h；二级种子：另加菜籽油；接种量3.5，培养8h；发酵培养基：硫酸铵，豆饼水解液，玉米浆，淀粉水解糖，碳酸钙，
19、pH7.2；3032，通气发酵60h，2550h 间不断补加尿素，氨水；预处理： 发酵液 10010min，冷却过滤，滤液加硫酸和草酸调pH3.5，过滤除沉淀；离子交换分离：滤液以1.5 树脂量的流速经007X1 （ 732）阳离子交换树脂H型（40X100cm ） ，100L 去离子水洗涤，氨水（60， 0.5M 氨水）以 3L/min 流速洗脱，分步收集；合并pH312 的洗脱液， 7080减压蒸馏浓缩到黏稠状，加去离子水，浓缩，重复三次，以除去氨；脱色，浓缩，结晶：浓缩液加去离子水到原体积的1/4，搅拌均匀， 2M 盐酸调 pH3.5，加1活性炭， 70搅拌 1h，过滤，滤液减压浓缩；2
20、M 氨水调 pH6，5过夜，滤取沉淀，105烘干得异亮氨酸粗品；精制： 取异亮氨酸粗品，加浓盐酸，去离子水，加热到80，搅拌溶解，加氯化钠到饱和，用氢氧化钠调pH10.5，过滤，滤液用盐酸调pH6，5过夜，滤取沉淀；沉淀用去离子水加热80溶解，加氯化钠和1活性炭， 70搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；氨水调 pH6，5结晶过夜；滤取结晶，105烘干得异亮氨酸粗品；天冬氨酸（酸性氨基酸）（1）特性： 白色菱形叶片状结晶，pI2.97；溶于水及盐酸，25水中溶解度0.8，75水中为 2.88；不溶于乙醇，乙醚；（2）制备，分离，纯化天冬氨酸酶的制备：大肠杆菌 AS1.881 ，斜面：肉汁培养基；摇瓶
21、：玉米浆，延胡索酸，硫酸镁， 氨水调 pH6；37振荡培养24h；逐级扩大培养； 发酵液用1M 盐酸调 pH5，451h，冷却到室温，离心收集菌体（含天冬氨酸酶）；细胞固定： 湿菌体，悬浮于生理盐水，40保温，加明胶溶液（40， 12） ，戊二醛溶液，充分搅拌均匀，5过夜，切成35mm 的立方小块，浸于戊二醛溶液中过夜；蒸馏水充分洗涤， 滤干得含天冬氨酸酶的固定化细胞；装于填充床式反应器，制成生物反应堆，备用；转化反应： 延胡索酸铵底物液37，按一定流速流过生物反应堆，收集转化液；分离，纯化：过滤，滤液用1M 盐酸调 pH2.8，5结晶过夜；滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干， 105干燥得天冬氨酸
22、粗品；粗品用稀氨水溶解成15溶液，加1活性炭， 70搅拌脱色1h，过滤，滤液用1M 盐酸调 pH2.8，5结晶过夜，滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干， 85真空干燥得天冬氨酸精品；谷氨酸分离纯化精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 12 页利用谷氨酸与锌作用,在 pH6.3 条件下生成难溶于水的谷氨酸锌盐沉淀,达到从谷氨酸发酵液中分离谷氨酸的目的。然后,于酸性条件下溶解谷氨酸锌盐,再调至谷氨酸等电点,析出谷氨酸。谷氨酸钙 (19238-49-4) 的制备方法：由发酵法所得的谷氨酸，与氢氧化钙或碳酸钙中和后脱色、结晶精制而成。赖氨酸
23、的提取（1）发酵液除菌体及滤液酸化发酵液中加入絮凝剂絮凝后过滤除菌体，也可用高速离心液固分离设备直接分离出菌体，回收的菌体可进一步加工利用，澄清的滤液用盐酸调节PH4.0 后待用。（2）离子交换提取赖氨酸的离子交换提取一般用铵型732树脂离交结束后，要用水洗柱，以除去可溶性和非可溶性杂质，提高赖氨酸质量，水洗后，用 2-3mol/L 浓度的氨水洗脱，洗脱高峰赖氨酸含量可达6-8%，如用高浓度氨水 （15-20%）洗脱，洗脱高峰赖氨酸浓度可达15-16% 第十八章蛋白质的分离纯化（重要）（两性解离）1、蛋白质的提取：蛋白质在不同溶剂中的溶解度，取决于蛋白质分子中非极性疏水基团和极性亲水基团的比例
24、，以及这些基团在蛋白质中相对空间位置；水溶液提取： 蛋白质提取中最常用的溶剂；盐浓度：低浓度盐溶液和缓冲液可提高蛋白质在溶液中的稳定性及溶解度；等渗盐溶液，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 12 页如 0.02-0.05M 磷酸盐缓冲液或0.15M 氯化钠溶液；如果是胞外蛋白质，等渗溶液可减少胞内蛋白质的释放；有些蛋白质在低浓度盐溶液中溶解度低，提高盐浓度，如脱氧核糖核蛋白， 1M 以上的氯化钠提取；有些蛋白质在盐溶液中溶解度低，用水提取；2、包涵体制备：菌体细胞破碎：如超声波法；包涵体的洗涤和收集：含不同添加剂的磷酸盐缓
25、冲液，离心收集沉淀；（1） 包涵体溶解前处理：用温和表面活性剂如TritonX100或低浓度弱变性剂如尿素处理，除去脂质和部分膜蛋白，浓度以不溶解包涵体中表达产物为原则；（2） 包涵体溶解，表达产物变性包涵体溶解：盐酸胍，尿素 ：破坏离子间相互作用，解除维系蛋白质稳定性的非共价键，引起蛋白质的去折叠和变性，但不破坏共价键；SDS：破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用；先进行预实验：测定包涵体中表达产物开始溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间；一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为58M，尿素为68M ，SDS 为 12；（3） 重组蛋白的复性：溶液稀释，使变性剂浓度变低，促使蛋白质复性；通过透析，超滤，
26、电渗析除去变性剂；3、 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子分离纯化（重要）（pI5.4）分离和纯化，以包涵体的形式表达；（1） 收集菌体细胞：发酵后的工程菌，7000rpm30min，50mM Tris 盐酸缓冲液反复洗涤，离心三次，去上清；（2） 细胞破碎，包涵体收集：菌体细胞，加4 倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液（含5mM EDTA ） ，冷浴搅匀，超声破碎器中破菌，每次30s，间隔30s，反复破碎直到革兰氏镜检无完整的菌体；5000g 离心 30min，去上清，沉淀含包涵体（3）包涵体的洗涤： 沉淀加 9 倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液 （含 0.5% TritonX100 ） ， 500
27、0g离心 30min，沉淀加9 倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液（含0.5M 脲）同法离心，沉淀加入6倍体积 20mM 磷酸盐缓冲液（含5mMEDTA ） ，10000g 离心 30min ，收集沉淀；（4） 包涵体的变性与复性：沉淀加 8M 脲，振摇12h，40000g30min ；逐步稀释法将脲浓度稀释到0.1M，复性 24h， 17000g30min，上清液为复性粗产品；（5） 色谱纯化：1）疏水色谱PhenylSepharose6FF色谱柱用50mM 磷酸 7硫酸铵（ pH6.9）平衡；复性粗产品加硫酸铵使浓度达7，上样，用50mM 磷酸 7硫酸铵（ pH6.9） ，20mM 磷酸盐缓冲
28、液（pH7） ，30异丙醇依次洗脱，280nm 紫外检测，收集洗脱峰，电泳检定；2）离子交换色谱装 DEAE SepharoseFF色谱柱， 20mM 磷酸盐缓冲液（pH6.5） ，20mM 磷酸盐 0.15M氯化钠 （pH6.5） ，20mM 磷酸盐 1M 氯化钠 （pH6.4）分别洗脱， 收集洗脱峰， 电泳检定；3）凝胶色谱装 SephacrylS200 色谱柱， 20mM 磷酸盐 0.15M 氯化钠（ pH6.5）平衡，上样后以相同缓冲液洗脱， 收集吸收峰， 产品经 0.2um 滤膜过滤； HPLC 检测为单一峰， 纯度 99；SDSPAGE 显示为一条带；4、重组胸腺素 1（pI4.2
29、）分离纯化（1） 菌体的收集与裂解：离心收集菌体，盐酸胍（7M ，pH7.5） 4搅拌裂解3h，离精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 12 页心收集上清；（2） 透析除盐酸胍：上清液用生理盐水2000ml 透析 24h，中间换一次生理盐水；离心收集上清，用磷酸盐缓冲液（10mM，pH5.5）2000ml 透析 24h，中间换一次PB；离心收集上清；（3）融合蛋白的纯化：SPSepharoseFF 阳离子柱用PB（ 10mM ，pH5.5）平衡，上样时收集穿过峰液；DEAE SepharoseFF阴离子柱用上述缓冲液平衡，上样
30、后用0 0.5M 氯化钠的 PB 梯度洗脱，收集主峰，用水透析除盐，测蛋白浓度，冷冻干燥得融合蛋白；（4） 融合蛋白的裂解：按蛋白质： CNBr 为 1：3 的比例， 加入到 70的甲酸溶液中混匀，避光室温裂解24h，加 10 倍体积纯水灭活CNBr ，橱内充分排风30min，冷冻干燥；（5） 单体的纯化： SP SepharoseFF阳离子柱用醋酸钠醋酸缓冲液（10mM ，pH5）平衡，冻干样品加缓冲液溶解，4搅拌过夜，离心上清过SPSepharoseFF 阳离子柱；收集穿过峰液， 冷冻干燥； 用 Tris盐酸缓冲液 （50mM ，pH8）溶解后上QSepharoseFF阴离子柱，用 00.
31、5M 氯化钠溶液梯度洗脱，收集主峰，测定蛋白浓度；HPLC 法检定产品纯度98以上；5、人神经细胞生长因子（pI8.86 ）分离纯化：以人胎盘为原料提取hNGF；（1）胎盘绒毛的分离：取人胎盘，用注射器向脐带总动脉注入生理盐水，并轻揉胎盘，直到洗尽血污，分离绒毛叶；（2）提取：取来自 100 个胎盘的绒毛叶剪碎，加 20预冷的 PBS（pH6.8，含 1mMEDTA ） ；匀浆，每次3min，共 3 次；48000rpm30min ；上清以尼龙膜过滤，除去脂肪；滤液中加尿素到 5M，调 pH4，静置 2h，以解离hNGF 高分子聚合体；8000rpm30min ，收集上清；（3）超滤分离：上清
32、液以分子量截留值为30KD 的超滤膜超滤，滤液再用10KD 的超滤膜超滤；当截留液剩下1000ml 时，加pH4，50mM 醋酸钠醋酸缓冲液2000ml，再浓缩到1000ml，反复 5 次，收集截留液，对平衡缓冲液充分透析；（4） 离子交换色谱纯化：CM52 离子交换纤维柱，平衡缓冲液平衡，透析液上样，以平衡缓冲液洗脱穿过峰，换用Tris 盐酸缓冲液（pH9，50mM ）洗脱，收集洗脱峰（含hNGF） ；从 100 个胎盘中提取纯化得hNGF148.6mg ；SDSPAGE 银染显示为单一条带；HPLC 层析得单一峰；6、L 天冬酰胺酶（pI4.6）分离纯化（1） 菌体丙酮粉的制备：天冬酰胺酶
33、为胞内酶；丙酮脱水， 脱脂制成细胞干粉来破坏细胞；（2） 提取：菌体粉悬浮于硼酸硼酸钠缓冲液中（pH8，0.01M ）37搅拌1.5h，将胞内酶抽提出来，离心，收集上清液；（3） 盐析分离：离心上清液中加硫酸铵使饱和度43，充分沉淀后离心，除去杂蛋白沉淀，上清液中加硫酸铵使饱和度85以沉淀酶，充分沉淀后离心，收集沉淀；（4） 脱盐：沉淀溶于蒸馏水，利用分子量截留置为10kD 的膜超滤，浓缩到一定体积后，向浓缩液中加蒸馏水使达到原来的体积，如此反复使透过液中检不出硫酸根离子为止；（5） 沉淀粗酶：浓缩液pH 调到 L 天冬酰胺酶pI 附近（ pH4.34.5） ，加入 2 倍体积冷丙酮使酶沉淀；
34、抽滤收集沉淀，挥尽丙酮，得天冬酰胺酶粗品；（6） 纯化：乙醇分级沉淀：酶粗品溶解，中性条件下加1.1 倍酒精，沉淀除杂蛋白，清液用醋酸调pH 到 pI，继续加乙醇沉淀酶；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 12 页第十九章 核酸的分离纯化DNA 和 RNA 都是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇，乙醚，氯仿；钠盐比游离酸易溶于水；1、RNA 的提取组织捣碎，制成组织匀浆，用 0.14M 氯化钠提取 ，把细胞质中RNA 蛋白提取出来，留下含DNA 的细胞核物质，调节pH4.5，沉淀 RNA 蛋白；2、RNA 的分离纯化（1） 氯仿
35、处理：将RNA 蛋白溶液与等体积的氯仿戊醇（3：1）剧烈振荡，离心，上层水溶液含RNA ，蛋白质，下层为氯仿和戊醇；两层之间为变性的蛋白质；上层水相再用氯仿戊醇混合液处理；并反复数次，到两层之间无蛋白质胶状物为止；也可将 RNA 蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，用含少量辛醇的氯仿长时间连续振荡多次，除蛋白质， RNA 留在水溶液中；溶液中的 RNA 可通过加入2.5 倍量的冷无水乙醇使RNA 以钠盐形式沉淀下来；（2） 苯酚处理法： 90的新蒸馏苯酚提取，冷冻离心，RNA 溶于上层水相中，变性蛋白质和 DNA 留在酚层内，需反复多次；将含 RNA 的水相合并后加入相当于2.5 倍体积的冷无水乙醇，将R
36、NA 沉淀出来；制备 RNA 时常加入皂土，以吸附蛋白质和RNA 酶等杂质，抑制RNA 酶对 RNA 的降解；加少量 8 羟基喹啉以防止苯酚的氧化；（3）去污剂处理法：用SDS 等去污剂使蛋白质变性沉淀，然后离心去除沉淀，再用冷乙醇将 RNA 沉淀出来；（4） 盐酸胍处理法：盐酸胍溶液，终浓度2M ，38，大部分蛋白质溶解，再冷到0左右， RNA 沉淀出来，离心获得RNA 沉淀；不能完全去除RNA 中的蛋白质，需用氯仿处理法进一步除去产品中的蛋白质；（5） 浓盐处理法： RNA 蛋白溶于10氯化钠溶液中，加热到90，离心除去不溶物，加乙醇使 RNA 沉淀，或调节pH22.5 使 RNA 沉淀；
37、3、DNA 则用 1M 氯化钠提取第二十章 多糖的分离纯化（一般以阴离子形式存在，可离子交换法和季铵盐沉淀法（沉淀用高离子强度的盐溶液溶解）分离纯化，另外，多糖溶于水，不溶于乙醇，可用水提取，用乙醇沉淀）利用离子交换法的洗脱方式：逐步提高盐浓度 （梯度洗脱） ，或分步提高盐浓度 （阶段洗脱） ；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 12 页生物碱（酸提碱析）例如：苦参粗粉，2%盐酸溶解；过滤，收集（滤液） ；加乙醚，目的是（脱脂，脱色） ；加 NaCO3 碱化，用（氯仿）萃取，加NaCl 的目的是（促进目的产物进入萃取相）
38、；离子交换法纯化长春碱：离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的富集研究通过 D-113、110、D-151、001x7、D-072 、D-062 离子交换树脂对长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的静态吸附容量、吸附率和解吸率等指标的考察,筛选出最佳树脂为D-151. 吸附 :上样溶液浓度为0.41mg 生药 /mL, pH 为 6.0,流速为 3mL/min; 解吸附 :洗脱剂为20%乙醇除杂 ,90%乙醇 (含 2%氨水 )洗脱 . 洛伐他汀羧酸上强碱（阴离子）树脂：洛伐他汀在发酵中以洛伐他汀羧酸形式存在于菌丝体内, 在加入氢氧化钠的碱性条件下可以洛伐他汀酸钠的形式而溶水。根据这一特
39、性, 以 6mol/L 氢氧化钠调整发酵液pH11；采用大孔阴离子交换树脂D273 作吸附剂 , 洛伐他汀发酵液预处理后树脂吸附，流速1/30; 解吸采用添加4%氢氧化钠的75%乙醇 , 流速 1/100。离子交换纤维对银杏叶黄酮静态吸附和解吸的研究：黄酮（酸性）用碱性树脂：在静态条件下 ,用强碱性阴离子交换纤维分离纯化银杏叶中的黄酮. 最佳吸附条件为:溶剂为 20%乙醇溶液 ,黄酮浓度为0.4045 mg/mL, 温度为 70,pH 值为 4; 最佳解吸条件为:解吸剂为70%乙醇溶液 ,温度为 70 ,酸度调节剂为3 mol/L 的盐酸 ,且酸度调节剂与解吸剂的体积比为14. 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 12 页大孔树脂吸附分离长春花中的文多灵、长春质碱和长春碱：筛选出 AB-8 大孔吸附树脂作为分离长春花生物碱的载体，长春花原料用稀硫酸溶液提取，提取液用氨水调节pH 值为 8，然后采用AB-8 大孔吸附树脂柱吸附，用 20%乙醇洗涤除去强极性成分，在 30下用 pH=4 的 50%乙醇解吸，得单吲哚生物碱文多灵和长春质碱，再用 90%乙醇解吸，得双吲哚生物碱长春碱黄酮类物质沉淀：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 12 页