浙江大学生物化学丙实验报告6.doc

,. 专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310 装 订 线 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 质粒DNA的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA的提取 ②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、 实验原理 ①质粒： 质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤： a细菌培养使质粒大量扩增； b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ； c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA： 在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。 ④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定: DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。 ⑤影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有： DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。 DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA。 胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％； 电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。 碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大。 ⑥质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度： 环形双链DNA分子有三种构型。 第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快； 第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢； 第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。 这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。 ⑦实验有关试剂的作用： 溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。TrisHCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。 溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。 溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/L NaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。 酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。 氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。 70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。 RNaseA——用于消化质粒DNA溶液中的残余RNA。 3、 实验材料与试剂 1、实验材料 含重组质粒菌种 2、实验试剂 ⑴ LB液体培养基 ⑵ 氨苄青霉素：100mg/ml ⑶ 溶液Ⅰ ⑷ 溶液Ⅱ ⑸ 溶液Ⅲ ⑹ 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） ⑺ 无水乙醇 ⑻ 70%乙醇 ⑼ TE缓冲液（pH 8.0） ⑽ RNaseA（1mg/ml） ⑾ 0.5TBE缓冲液（pH8.0） ⑿ 琼脂糖 ⒀ 6加样缓冲液 ⒁ 1mg/ml溴化乙锭（EB） 4、 实验器材与仪器 1、恒温培养箱 37℃； 2、恒温摇床 37℃； 3、高压灭菌锅； 4、超净工作台； 5、台式离心机； 6、振荡器； 7、微量移液枪(10，20，200，1000ul)； 8、枪头（10，20，1000ul）及枪头盒； 9、离心管 1.5ml及离心管架； 10、制冰机； 11、冰箱； 12、干式恒温器 37℃、50℃ ； 13、微波炉； 14、电泳仪及； 15、电泳槽； 16、紫外检测仪。 五、实验操作方法和步骤 1、收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA，纯化质粒DNA ①去除核DNA，粗提取质粒DNA 离心：取1.2ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min；弃上清液， 将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。 冰浴：将菌体沉淀加100ul溶液Ⅰ，振荡悬浮菌体，冰浴放置5～10min。 再离心：加200ul溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀 使之变清，冰浴10min。加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰浴 放置5min。（说明：以上步骤目的） ②去除可溶性杂蛋白等杂质，纯化质粒DNA 离心：12000r/min离心10min，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积的酚：氯仿： 异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心 10min 。 冰浴：上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min。 离心：12000r/min离心10min，弃上清液，将溶液管口倒置吸水纸上，使液体尽可能流尽。 ③去除核RNA 加样：加入1ml 70﹪乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70﹪乙醇溶液，将管口倒置于吸水 纸上，使液体尽可能流尽，自然干燥或50℃干燥。 保存：将沉淀溶于50ul TE缓冲液（pH8.0，含20mg/L RNaseA）中，置37℃恒温器中保温 30min后，取质粒DNA样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余纯化的质粒DNA样品置于 -20℃保存备用。 2、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ①加样：取5ul纯化的质粒DNA样品，与1ul 6电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心 加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过 样品槽容量。 （注：a勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡；b上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样 品槽底部凝胶刺穿；c每加完一个样品要换枪头以防互相污染。） ②电泳：加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝 条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。 ③观察和拍照：取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带， 再用成像仪进行拍照，以便于分析。 注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。 6、 实验数据记录和处理 1、样品离心后：上层淡黄色，下层有乳黄色沉淀； 2、加入溶液Ⅰ后：沉淀溶解，溶液呈淡黄色； 3、加入溶液Ⅱ后：溶液无色澄清； 4、冰浴后：部分凝固，呈现无色； 5、加入溶液Ⅲ后：有白色絮状沉淀出现； 6、离心后：溶液分层，沉淀白色，有部分粉末悬浮； 7、加 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）后：分层，下层颜色土黄色，上层淡黄色； 8、离心后：分层，上层无色透明，下层淡黄色，中层杂蛋白油状。 七、实验结果与分析 电泳图谱： 1、 实验结果： ①第一条带对应的DNA为超螺旋构型DNA，条带最亮，表明此结构的DNA含量最高，同时其迁移距离最远，在同样时间内，超螺旋构型DNA迁移速度最快，结果正常。 ②第二条带对应的DNA为线状DNA，在三条带中颜色最浅，含量最少。 ③第三条带对应的DNA，为开环DNA，迁移速度最慢，含量较线状DNA微多一些。 ④点样孔处有较多DNA残留，表明加样时有较多溢出，操作不够规范，仍需改进。 ⑤在第一条带之前无其它可辨的条带，可推测无RNA残留。 2、 结果分析： 根据实验结果得出如下分析：①在加样时，未控制好位置和高度，导致残留在点样孔中的样品较多，因此也影响了各个条带中的样品量，若在加样时操作规范，则可增大条带中DNA的量。②各个条带之间距离较大，表明超螺旋构型DNA、线状DNA、开环DNA三种不同类型的DNA之间分离较好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。③但仍存在较多开环和线状DNA含量也较多，表明提取到的DNA杂质较多，原因可能为没有在洗涤沉淀时进行充分洗涤，只是稍微放置一会后就将乙醇倒掉了，应多放置一段时间，并微微摇动，以除去杂质。④由于在第一条带之上不再有其它可辨的条带，可推测无RNA残留。说明DNA纯度高，提取过程对RNA的去除完全。 八、讨论、心得 思考题： 1、在提取质粒DNA的过程中， EDTA、 SDS、 NaOH、乙酸钾、酚-氯仿-异戊醇等试剂的作用是什么？ EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 SDS：：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。 乙酸钾：质粒DNA复性。 酚-氯仿-异戊醇：酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡（泡沫）。 其余试剂见实验原理部分。 2、在质粒DNA的提取过程中，应注意哪些操作，为什么？ （1）各步骤中的混匀过程要温和，因为质粒DNA是环状生物大分子，若是过于剧烈，极易收集到破碎、断裂的片段而不是完整的超螺旋DNA； （2）各步骤中的试剂的量要适当，过量和不足都会影响实验结果。 （3） 提取过程中应尽量保持较低温度。 （4） 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。 3、琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节？ （1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60C，否则温度太高会使制胶板变形。 （2）胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样孔。 （3）配胶和灌电泳槽需使用同一缓冲液。pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA片段的泳动。 （4）加样时需将枪头深入加样孔内再吹出样品，以免样品从凝胶表面扩散；加样时枪头不要刺穿或碰坏凝胶孔壁，否则将导致样品将从凝胶底部扩散或DNA带型不整齐。此外点样孔内不能有气泡。 （5）样品应加在阴极端，没加完一个样品要更换枪头，防止相互污染。 （6）观察时在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜，赶去气泡。 （7）要选择合适的电压、pH等条件。 讨论心得： 1、 质粒在正常情况下以超螺旋构型存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。 2、 DNA泳动速率受到多方面因素的影响。 3、 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 4、 用无水乙醇沉淀DNA：乙醇可以任意比和水相溶，乙醇与核酸不会起化学反应，不会破坏DNA。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。本次实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混，其含量约为67%，因此可以考虑用95%乙醇，但是DNA回收率可能会下降。 5、 提取过程中应尽量保持较低温度。 6、 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。 7、 要尽可能充分利用提取物，可增加产率；但是在不同情况和实验要求下应在产率和质量之间进行必要地调节。 8、 对于实验步骤（二）中第5步的絮状沉淀不需要摇碎，摇碎沉淀一方面容易造成剧烈震荡，破坏DNA结构，另一方面破碎的沉淀可能会降低提取物的质量。 9、 观察时要注意安全，防止紫外线直射眼睛。 10、 实验过程应保持一定的连续性，不应当做做停停，以减少外界条件的影响。 附：琼脂糖核酸电泳实验操作流程 1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）； 3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去； 6.在DNA样品中加入10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可； 8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳； 9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。