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1、精品名师归纳总结丙型肝炎病毒细胞和动物模型的讨论进展摘要： 丙型肝炎病毒（ hepatitis C virus, HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要缘由之一，目前全世界约有 1.7 亿人感染 HCV 。由于缺少有效的HCV 细胞培育系统和小动物模型，人们对其生活周期、作用机制等仍不是很清晰，从而严峻阻碍了HCV疫苗及治疗药物的开发与研制。本文就近几年在HCV 细胞和动物模型方面的进展作一综述。关键词 ：丙型肝炎病毒细胞模型动物模型Progress in Establishment of HCV Cell and Animal ModelAbstract:Hepatitis C viru
2、sHCV is a major cause of chronic liver disease, such as chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, hepatocelhlar carcinoma, with over 170 million persistently infected individuals worldwide. Lack of proper study models has brought difficulties in the study of the mechanism of viral infection, life cycle
3、and pathogenic mechanism of HCV andalsobecomethe majorobstaclesin the developmentof efficientvaccineand newdrugsfor hepatitisC. Herethe advances on establishment of HCV infectious cell and animal models were reviewed.Key Words: Hepatitis C virusHCV。 cell model 。 animal model丙型肝炎是全球关注的公共卫生难题，目前全球约有1.
4、7 亿人感染 HCV ，我国进行的全国HCV 血清流行病学调查显示，我国一般人群抗-HCV 阳性率约为 3.2% ，全国共约 4000 万人感染 HCV ， HCV 是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要缘由之一。约50 -80 的 HCV 感染者会转变为慢性感染患者，而大约20 的患者会在 20 年内转变为肝硬化。一旦转为肝硬化，每年将会有1 5 的病人进展成为肝癌，严峻的威逼着人类的健康。长期以来，缺少合适的讨论模型始终是HCV 讨论的瓶颈，近年来 HCV 体外培育系统的建立使其相关讨论供应了强有力的工具，为从根本上熟悉HCV 奠定了基础。本文概述了近年来HCV 讨论模型的开发进展。1 HCV
5、 的基本分子生物学特点HCV 属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA 病毒，基因组全长 9.6 kb ，含有一个开放的编码区，可编码一个多聚蛋白前体，此多聚蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋 El（ Core 、E1 、E2 ）和 7 个非结构蛋白（ NS1 、NS2 、NS3 、NS4A 、NS4B 、NS5A 、NS5B ）。 HCV C 蛋白由 191 个氨基酸残基组成，是HCV 基因组中较为保守的结构区域。5UTR 区最为保守，而 3UTR 对于 HCV RNA的正常复制是不行缺少的（图1） 1 。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结图 1HCV 基因组结构
6、2 HCV 的细胞模型2.1 感染模型感染是建立 HCV 细胞模型最简洁直接的方法，是用HCV 阳性血清直接和 HCV 敏锐细胞共同培育使细胞感染。早在 1992 年， Shimizu 等2报道用鼠逆转录病毒感染人T淋巴细胞系 MOLT-4Ma 和 HPB-Ma ，再用可连续感染大猩猩的病毒株和上述细胞共培育，24 d 后仍可在细胞内检测到病毒RNA 的存在。随后用人淋巴细胞白血病病毒HTLV-I 预处理 MT-2 细胞系后再用 HCV 感染也得到类似的结果。讨论人员分别在HPB-Ma 、PBMC 、 Huh-7 、Hep-G2 和其他 SV-40 T 抗原永生化肝脏细胞系上也建立了HCV 连
7、续感染系统，同时观看到此感染效率与病毒体内滴度亲密相关，并可被相应抗体中和和干扰素抑制连续复制的病毒直径约为 50 nm ，采纳 RT-PCR 方法可间隙性检测出。 Iacovacci等3 就选用人胎肝细胞作为培育HCV 的靶细胞，用竞争性 PCR 定量检测病毒 RNA 分子，发觉培育后30d 达到 HCV 复制水平的最高值。他们仍发觉血清中病毒颗粒的蔗糖梯度密度为1.181.36g/cm3，而细胞和上清中检测到的病毒颗粒密度有高低两种（高： 1.181.36 g/cm3 。低： 1.051.105 g/cm3）。 Rumin 等4用HCV 阳性血清和人肝细胞共同培 养，观看 4个月，发觉这些
8、感染细胞在10d 后可检测到正链 RNA ，而培育上清中的 RNA 滴度在 3个月中也有了上升。而 Yoshikura H 等5用HCV 患者血清感染细胞时，也发觉了病毒颗粒密度有高低两部分，密度高的部分感染性低，低密度的感染性高。对于这种现象，他们认为可能是HCV 颗粒结合了抗 HCV 抗体， 导致了密度的增加，同时干扰了HCV 对细胞的吸附及在细胞中的复制，使HCV 对细胞的感染性降低。用抗人免疫球蛋白对这种血清进行免疫检测，证明了低感染性高密度HCV 的确结合有 IgG 抗体。用阳性血清感染细胞便利快捷，缺点但病毒复制产量较低，且不能长期传代培育。2.2 转染模型可编辑资料 - - -
9、欢迎下载精品名师归纳总结详细做法是利用 RT-PCR 方法获得的全长 HCV cDNA ，采纳各种方法将其转染进入易感细胞，通过胞内逆转录可产生和病毒相同的RNA 转录本，从而模拟病毒的感染过程。相对于HCV 病毒直接感染的细胞培育系统，克隆的病毒基因组转染模型保证了用于感染细胞的基因组的同源性，且能够在体外大量合成。 Kishine 等6从感染细胞提取 HCVRNA ，逆转录出 cDNA ，将其改造后（ 剔除结构基因，保留与复制有关的非结构基因和 3NCR、5NCR，以保证不影响复制）整合入pBR322MC 中，并插入抗 Huh-7基 因、 ECMV-IRES，构建重组质粒 pNNR22RU
10、 ，转染 Huh-7 细胞培育，再从中挑选抗G418 的Huh-7 细胞进行亚克隆。最终从这些细胞克隆中检测到病毒产物（非结构蛋白）和亚基因RNA 。 试验结果说明 HCV 亚基因复制子能在一些细胞培育系统中有效复制，并维护较长的时间，有利于将来进一步讨论丙肝病毒复制机制及新药挑选。Pietschmann等7 把构建好的挑选性全长 HCV 基因转入 Huh-7中，并进行 3 个突变来加强在细胞中的复制，结果发觉能在细胞中连续检测到该基因达6个月，结构蛋白稳固表达。Lohmann等8 在讨论 HCV 在细胞中复制时，发觉 Huh-7是较好的病毒培育的细胞系统。挑选性亚基因复制子也需要核苷酸突变来
11、加强病毒复制，NS3 的突变对复制作用小，但在联合高适应性突变时能加强病毒复制。而NS5 、NS4B 的适应性突变作用可直接加强复制。另外也发觉宿主细胞在RNA 有效复制时也起了特别重要的作用，他们检测了相同Huh-7 细胞系的几代，发觉不同代次的Huh-7 在支持复制子扩增的才能相差100 倍。这些数据资料说明在细胞培育中HCV 的复制有效性很大可能是由病毒序列和宿主细胞本身共同打算的。3 动物模型3.1 黑猩猩黑猩猩是公认的最好的 HCV 感染试验动物。已经证明HCV 在黑猩猩体内复制，黑猩猩对HCV 的应答过程与人类相像。Shimizu 等2 讨论发觉，黑猩猩接种HCV 后3-4 天即可
12、于血清中检测出HCV RNA ， 7天时HCV RNA 水平达到峰值，为10 7 -108 CID/L ，同时血清 ALT 水平最高。感染后3 天，肝细胞活检可检测到HCV RNA 。同人类一样，感染 HCV 的黑猩猩中有很大比例40% 由于机体免疫系统不能清除病毒，而进展成连续性感染。人与黑猩猩在HCV 转为慢性感染的比例上的差别，可能是由于有很多患者急性期临床表现不明显而未能发觉。但HCV 在宿主体内是如何逃防止疫监视而进展为慢性感染的机理仍不清晰。病理学讨论说明，黑猩猩的肝脏损害没有人类严峻，观看不到肝纤维样变性和肝硬化，但在组织形状学和坏 死性炎症病变方面与人相像。总的来说，在人和黑猩
13、猩身上所观看到的临床参数比较接近，用黑猩猩来讨论病毒在体内复制情形和发病机理及挑选HCV 疫苗都是特别有价值的。但由于黑猩猩作为丙肝模型缺乏慢性肝病的表现，使得在肝硬化和肝细胞癌发病机理的讨论方面受到限制9。此外，费用等问题也限制了它的应用范畴。3.2 猴GBV-B 是近年来发觉的黄热病毒属中的一员，是一种单股正链RNA 病毒，在全部的动物病毒中，可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结GBV-B 与HCV 有高度核酸同源性，其多聚蛋白在氨基酸水平上有25 30 的同源性，因此推测治疗 HCV 感染的抗病毒化合物同样会对GBV-B 有作用，使得 GBV-B 作为 HCV 的替代病毒建立
14、感染模型成为可能。 GBV-B 可以感染绒猴， GBV-B 感染绒猴 40-60 d 后可达到 108 10 9拷贝， 60-80 d 后病毒逐步被清除。原代培育的绒猴肝细胞培育上清中及细胞中也胜利的检测到了GBV-B 的感染。用 HCV 蛋白酶抑制剂可以 有效降低体外培育绒猴肝细胞上清中及绒猴体内的病毒含量。Martin 等10用合成的 GBV-B RNA直接注射入小绢猴的肝脏，可诱使其产生连续性GBV-B 感染，两个感染动物中有一个感染后病毒血症超过2 年，且显现了门静脉四周单核细胞浸润、线粒体结构转变及脂肪变性等慢性肝炎的组织病理学转变11。近年有关猴作为 HCV 感染模型的报道不多，其
15、作为可供讨论HCV 使用模型的可能性有待验证。3.3 树鼩树鼩是一种与灵长类亲缘关系较近的哺乳动物，对多种人类病毒，包括甲、乙和丁型肝炎病毒易感。 Xie 等12对树鼩进行病原接种发觉，仅有1/4 能感染 HCV ，在体内检测到短暂或间歇的低效价病毒血症。 如树鼩接受 cGy750 照耀后再进行病原接种，HCV 感染效率、病毒血症及抗体效价均明显提高。但由于树鼩是野生动物，试验室饲养困难，广泛应用受到限制。3.4 小鼠3.4.1 转基因小鼠模型小鼠主要有转基因小鼠模型、质料转染鼠模型和人鼠嵌合体肝移植鼠模型。转基因技术自1980 岁月初进展起来现已成为生命科学领域中普遍应用的常规技术手段，HC
16、V 转基因小鼠主要为结构基因转基因小鼠，在病毒导致肝炎、肝脂肪及肝癌的致病机制方面的讨论起了很大的作用。Pasquinelli 等13 将编码HCV 结构蛋白的 C 、E基因分别插入到鼠主尿蛋白下游，建立携有HCV 基因片段的转基因小鼠。这种对T 细胞免疫应答功能的抑制可能是由于HCV 感染增强了 T 淋巴细胞对 Fas- 介导的细胞凋亡的敏锐性，HCV核心蛋白可能是通过促进Fas- 介导的 T 淋巴细胞凋亡以及肝脏的T 淋巴细胞浸润而导致肝损耗。HCV 各组成蛋白的致癌机制也是以HCV 转基因小鼠模型进行讨论的，Kato 等14 发觉在饲养了 1824 个月后， HCV 核心基因转基因小鼠的
17、肝脏内均未显现肿瘤，但是经四氯化碳处理后可发生肝细胞癌，因此认为HCV 核心蛋白导致的肝细胞再生速率的提高可能是增强肝脏发生癌变机率的机制之一。成军等15 发觉约 80% 的HCV 结构基因的转基因小鼠模型发生肝脏等内脏的脂肪变，为讨论HCV 慢性感染引起的脂肪变奠定了基础。 Kamegaya 等16 将HCV E1 蛋白、 E2 蛋白和核心蛋白的转基因小鼠用DEN 处理后于第 32 周处死，然 后检测细胞的增殖和凋亡情形，发觉两组小鼠与正常小鼠间的细胞增殖没有显著差别，但核心-E1-E2 转基因小鼠的较大，而凋亡指数却小于核心基因转基因小鼠，因而认为HCV 结构蛋白促进肿瘤生成的缘由可能是由
18、于抑制肝细胞凋亡而并不是促进肝细胞增殖。虽然转基因小鼠作为HCV 感染模型的报道较多， 但各方讨论不尽相同，且存在很多问题，转基因小鼠处于免疫耐受状态，对HCV 导致肝细胞损耗的原因，到底是病毒的直接作用仍是病毒与机体免疫系统的相互作用尚有争议，并难以用于疫苗的研发。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结3.4.2 质粒转染鼠模型由于 HCV 病毒不能直接感染小鼠，因此人们尝试用含有HCV 的质粒转染小鼠肝细胞或体内转染的方法表达 HCV 蛋白。詹林盛等 17 用含内部核糖体起始位点IRES 的HCV 5NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因融合，然后插入含CMV 启动子的 P
19、ci-neo 质粒中，得到真核表达质粒Phcv-neo4 ，进一步采纳水动力转染法将 pHCV-neo4 表达载体转染到小鼠体内，在小鼠肝脏检测到荧光素酶的高水平表达，同时HCV IRES 介导的荧光素酶在小鼠心、脾、肾脏组织中也得到表达，但表达量仅为肝脏的1 100 l1 000 ，可以作为体内瞬时评判以HCV IRES 为靶位的抗 HCV 药物活性的小鼠模型。3.4.3 人鼠嵌合体肝移植鼠模型此方法是在免疫缺陷小鼠体内移植人肝细胞，通过肝门静脉或脾髓注射，使小鼠感染HCV 。Brown 等19 利用原代或无限增殖的人肝细胞进行试验，结果说明所建立的HCV 小鼠模型可用于 HCV 的体内讨论
20、。 Mercer 等20通过在纤维蛋白溶酶原激活蛋白转基因的SCID 小鼠肝脏内植入正常人肝组织，然后接种HCV 患者血清建立了一种 HCV 嵌合感染的小鼠模型，该小鼠的肝脏中能检测到病毒RNA 的复制。其体内病毒滴度最高能达到 1:1950 ，而且这种感染能连续传递三代。Galun 等21采纳的方法是给免疫缺陷小鼠（ BNX ）以放射性照耀，然后用免疫缺陷小鼠的骨髓细胞进行重建，再把感染了HCV 患者的肝碎片移植到用前述方法所制备的小鼠肾被膜下。这种三联体小鼠在移植后1015 天内，有 50% 以上用 RT-PCR 法可以检测到 HCV RNA 。 Ilan等22 报道三联体 HCV 小鼠感
21、染率为 85% ，且可以用抗病毒药物减轻小鼠的病毒血症，但这种方法由于免疫排斥，肝存活时间较短，且病毒血症水平较低，而影响该鼠对人肝细胞产生免疫耐受。4 结语近几年，在建立 HCV 动物模型技术上有了很大突破。新的动物模型基本上都是在人鼠嵌合体转基因小鼠基础上建立的，必将为HCV 的讨论带来新的突破。鼠的免疫缺陷恰恰能满意异种动物成分的介入， 从而扩大了 HCV 模型的应用。但是仍有待于进一步讨论更加便利、精确的小动物模型，进行有关发病机制、药物以及疫苗方面的讨论。参考文献1. Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. Cyclosporine A
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