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1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离一、基础知识一、基础知识：（一）（一）蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法）电泳法（三）缓冲液的作用（三）缓冲液的作用二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤 血液组成成分血液组成成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白样品处理样品处理和粗分离和粗分离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据 蛋
2、白质的物理化学性质差异：蛋白质的物理化学性质差异： 1.1.分子的形状、大小分子的形状、大小 2.2.电荷性质和多少电荷性质和多少 3.3.溶解度溶解度 4.4.吸附性质吸附性质 5.5.对其他分子亲和力对其他分子亲和力 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 （1）原理：）原理：（2 2）材料：凝胶）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，如，如葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的内部有许多贯穿
3、的通道通道.根据相对根据相对分子质量的大小分子质量的大小分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法概念：概念：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 2凝胶电泳法：凝胶电泳法：1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、电量、形状和大小形状和大小不同，在电场中受到的作用力不同，在电场中受到的作用力大小、方向、大小、方向、阻力阻力不同，导致不同蛋
4、白质在电场中的不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向运动方向和和运运动速度动速度不同。不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可解离的基团会带上电荷，蛋白质可解离的基团会带上电荷3）常用电泳方法常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDS复合物复合物”，
5、使蛋白质，使蛋白质迁移速率仅迁移速率仅取决于分子大小取决于分子大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定运动方向运动方向电场电场作用作用力力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小由由弱酸弱酸和相应的和相应的强碱弱酸盐强碱弱酸盐溶解于溶解于水水中。中。如如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等等（4）缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂 作用：作用： 配制：配制：调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保
6、持的干扰而保持 pH稳定。稳定。（模拟生物体内的过程）（模拟生物体内的过程） 思考：如何配制不同思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？值不同的缓冲液？血液组成成分血液组成成分阅读思考：阅读思考：1. 血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2. 血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是最高的化合物是_。3. 该化合物是由该化合物是由 _和和_构构成的，其中每个亚基中都含有一个能与成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和和CO2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红
7、素1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读思考：洗涤的阅读思考：洗涤的目的目的是什么？洗涤的是什么？洗涤的方法方法是什么？是什么？洗涤干净洗涤干净的标志是什么？的标志是什么？血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至上清液没有黄色直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速
8、释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1. 蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2. 加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心离心管管烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析血红蛋白透析的目的是什么？透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋去除血红蛋白
9、中的小分白中的小分子杂质子杂质纯化纯化凝胶色谱操作凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：教材图教材图5193.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡
10、聚糖凝胶G-75 20mmol/LG-75 20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液“G”“G”表示什么？表示什么？7575代表什么？代表什么？注意注意： 色谱柱不能内不能有色谱柱不能内不能有气泡气泡； 装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝 胶是凝胶胶是凝胶装填紧密装填紧密3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 1.调液面调液面 2.加样加样 3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝胶凝胶注意事项注意事项1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3. 凝胶的预处理凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4. 色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动。知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定