2022年应用生物技术教案 .pdf

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1、名师精编优秀教案绪论教学时数1 教学重点植物组织培养的概念及理论依据。教学难点无教学目的要求学生掌握植物组织培养的概念及依据，了解植物组织培养的依据和发展概况。教学方法讲解、讲授法。一植物组织培养的概念和重要性1植物组织培养（plant tissue culture） ：是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、 分化形成完整植株的过程。根据培养的对象不同，组织培养可分为器官培养、组织培养、胚胎培养、 细胞培养和原生质体培养等。根据培养过程， 将从植物体上分离下来的部分进行第一次培养，称作初代培养（primary cu

2、lture ） ，以后将将培养物转移到新的培养基上继续培养，则统称为继代培养（subculture） 。根据培养基物理状态，把加入琼脂使培养基呈固态的培养，称固体培养（solid culture） ；不加入琼脂而培养基呈流体状态的培养，称液体培养（liquid culture） 。2植物组织培养的优越性：可以在不受植物体其它部分干扰的情况下研究被培养的部分（这部分称为外植体，explant）的生长和分化的规律。3植物组织培养的特点：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。4重要性：植物生物技术（又称植物生物工程）是按照人类的意愿

3、有目的地改良植物的一种技术， 它是当前世界新技术革命的一个重要组成部分。组织培养是植物生物技术的主要分支之一。组织培养在理论上是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段；在生产上在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛应用。可见组织培养无论在理论研究还是生产实践都是十分重要的。二植物组织培养的理论依据1植物细胞全能性组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性（totipotency） ，所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株。要使细胞全能性表达出来，形成完整的植株，除了生长以

4、外，还要经过分化、脱分化和再分化等过程。当将离体组织或器官放在培养基上进行离体培养（in vitro culture）时，这些离体组织或精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 40 页名师精编优秀教案器官就会进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形状态的簿壁细胞，称为愈伤组织（ callus） 。由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组织的过程，就称为植物细胞的脱分化（dedifferentiation ） 。将脱分化的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出具有根、茎、叶的完整植株-再分化（ re

5、-differentiation ） 。2离体器官分化途径离体器官的分化方式有许多种，最常见的有三种：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体（embryoid ） ，由胚状体直接重建植株。三植物组织培养的历史根据细胞学说，德国植物学家Haberlandt 于 1902 年提出细胞全能性概念，认为离体培养的植物细胞具有通过胚胎发生过程而发育成完整植株的潜在能力。White 在 1939 年报道了由烟草种间杂种幼茎切断的形成层组织，进行组织培养获得成功并能继代培养，他提出了植物细胞全能性的学说。20 世纪 40 年代末 50

6、 年代初。 Skoog 和崔澄等人进行烟草髓培养诱导根、芽器官，获得成功。1958 年美国 Steward 等和德国Reinert 等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。 这从实验上证明植物细胞的全能性。我国的李继侗等曾作银杏离体培养，发现其胚乳提取物能促进离体胚生长。罗士韦是我国植物组织培养和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30 年代即开创离体根培养，随着又进行幼胚和茎尖培养。解放后，特别是70 年代以后，身体力行，指导植物组织培养技术的推广工作，取得了很大成效。近二三十年， 我国植物组织培养研究工作取得了很大成就，特别是在花药培养和单倍体育种上处于世界领先水平。在果树

7、、林业、花卉等方面也取得了很大成功。四植物组织培养的应用1无性系快速繁殖；2花药培养和花粉单倍体育种；3药用植物的工厂化生产；4种质的保存和基因库的建立；5突变体的筛选培育。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 40 页名师精编优秀教案第一章实验室设备和一般技术教学时数2 教学重点实验室设计和常用器材的使用。教学难点无菌概念和无菌操作。教学目的通过本章教学，让学生对植物组织培养实验室有个初步的认识，明白无菌操作的概念及其在组织培养中的重要性，掌握常用设备和器皿的基本操作。教学方法讲授、图示、参观及操作示范。第一节实验室设计植物

8、组织培养实验室通常包括通用实验室、接种室、 恒温培养室、 检查培养情况并做记录的细胞学实验室。此外还需有相应的花房和试管苗移栽房等。一通用实验室主要用于植物组织培养所需器皿的洗涤、干燥和保存，培养基的配制、分装和灭菌，化学试剂的存放及配制，蒸馏水的生产， 待培养植物材料的预处理及培养物的常规生理生化分析等操作。二接种室接种室主要用于植物材料的消毒和接种，培养物的继代转移等等。它是无尘、 无对流空气的非常洁净的实验室。要求进入室内的工作人员的衣物、鞋帽、头发、手和脸都要十分清洁，避免带入杂菌造成污染。1无菌操作室（顺便交代无菌操作概念）无菌操作室最好设有内外两间：外间是缓冲室， 内间是无菌操作室

9、，缓冲间可使工作人员进入无菌操作室前有一个过度，以减少将室外杂菌带入无菌操作室。无菌操作室是无菌操作的重要空间，墙壁和地面要光滑，便于清洗和消毒。室内要定期消毒、灭菌。2接种箱在条件较差的情况下，可考虑自制无菌箱来代替无菌操作室。现一般不常用。3超净工作台超净工作台一般由鼓风机、滤板、操作台、紫外光灯和照明灯等部分组成。根据风幕形成的方式， 可分为垂直式和水平式两种。超净工作台的工作原理是：鼓风机送入的空气经过细菌过滤板除去微生物后，再流过工作台面，并在操作人员和操作台之间形成风障，使杂菌不能进入，形成一个无菌的工作面。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - -

10、 - - - -第 3 页，共 40 页名师精编优秀教案三培养室培养室是培养试管苗的场所，要满足外植体生长所需的温度、光照、湿度和空气等条件。室内温度通常要求在25左右，一般采用空调机来控制。光源通常采用普通40W 的白色日光灯， 每层培养架安放24 支日光灯管。 有可能的话可考虑增设一个暗培养室，作为那些不需光照的外植体培养场所，如愈伤组织诱导等。培养室的墙壁最好用隔热性能良好的材料，少受外界温度的影响。培养室的湿度应保持在7080%。此外在培养室内可放置液体培养需用的摇床或旋转床等。四洗涤室大量生产时应另辟一个洗涤室，装有水槽以清洗用具，地面要耐湿并能排水。灭菌锅、蒸馏水器、干燥箱等可从通

11、用实验室移到本室，方便操作。除上述几种主要房间外，假如条件许可，也可以再建立摄影室、人工气候室、试管苗练苗室等。第二节常用设备和器材一高压蒸汽灭菌锅1种类：2原理3使用方法4注意事项二接种工具常用的有：双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等。三培养设备常用的有：空调机、定时器、温度控制器、增湿和去湿机、培养架、摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。四化学实验及分析设备天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱、电炉、药品柜、冰箱、废污物桶等。五培养物细胞学观察设备精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 40 页名师精编优秀教案主要包括显微

12、观察设备、组织切片染色用设备、照相冲洗设备。第三节玻璃器皿的选择与清洗一玻璃器皿的选择常见的有：试管、三角锥瓶、培养皿、果酱瓶等。二玻璃器皿的清洗1洗涤剂：肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤剂。一般用洗衣粉即可。2新购置的玻璃器皿由于它们或多或少含有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸内浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋一便，干后备用。3 对已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿则必须现在121高压蒸汽灭菌30 分钟后再清洗。4洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 40

13、页名师精编优秀教案第二章培养基及其配制教学时数3 教学重点培养基成分及其作用、培养基配制程序教学难点培养基配制程序及方法教学目的通过本章教学，使学生掌握培养基配制方法，了解培养基各成分的作用及不同培养基的特点。教学方法讲述、讲授结合实物演示及实验植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成分等直接影响材料的生长发育，故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。不同的培养基特点不尽相同，了解和分析它们的特点，既便于选择合适的培养基，又可在组织培养中开发新的培养基。第一节培养基的成分植物组织培养基都是由无机营养物、炭源、 维生素、 生长调节

14、物质和有机附加物等几大类物质组成。一无机盐无机盐包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯、镁。氮通常是指硝态氮或氨态氮，但在培养基中多以KNO3或 Ca（NO3）2的硝态氮形式来满足培养物对氮素的需求，或将两种混合使用，有时也以硝态氮为主，补加（NH4）2SO4以满足酸性植物的需要。磷是植物的必须元素之一，参与植物生命活动中核酸、蛋白质合成、光合作用、呼吸作用、及能量的贮存、转化与释放等重要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷。钾是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势。钙、钠、镁的用量较少。微量元素是指铁、 硼、锰、锌、钴、钼、铜等，其需要量

15、很少， 一般多为 10-510-7mol.L-1，稍多则产生毒害。二炭源和能源植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、 葡萄糖和果糖， 其中以蔗糖为最常用，效果也最好。 然而在体细胞组织培养中，葡萄糖、 麦芽糖和山梨醇也有影响；在花药培养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外，还具有维持培养基一定的渗透压的作用。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1%5%，但个别植物组织培养中蔗糖精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 40 页

16、名师精编优秀教案的浓度也可高达7%甚至 15%，如玉米、油菜等植物的花药培养。一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3： 13： 2，即约有1/42/5 的蔗糖用于保持培养基的渗透压。三维生素类维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素的种类很多，在植物组织培养中通常以B 族维生素为主， 使用浓度一般为0.11.0mg/L ，其中以盐酸硫胺素 （B1） 、盐酸吡哆素 （B6） 、维生素B12、烟酸、生物素和维生素C 最为常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。肌醇本身不促进外植体的生长，但可能有助于活性物质发挥作用，从而促进外植体生长、胚状体及芽的

17、形成。培养基中肌醇的用量为50100mg/L 。四氨基酸及有机附加物在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly） 、丝氨酸（ Ser） 、酪氨酸（ Tyr） 、谷氨酰胺（ Gln） 、天冬酰胺（ Asn）等，它们是培养基中重要的有机氮源。甘氨酸能促进离体根的生长， 对植物组织培养物的生长也有良好的促进作用，一般用量为23mg/L 。丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体的形成或不定芽的分化。水解酪蛋白 （CH） 和水解乳蛋白 （LH）也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L 。酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用。在某些植物组织

18、培养中还加入一些天然的有机物，例如椰子乳1020%，酵母提取物0.5%，番茄汁510%，香蕉泥100200mg/L ，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中加入100200mg/L 的香蕉泥， 具有较大的pH 缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大的促进作用。五植物生长调节物质生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少， 但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。（一）生长素它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋

19、芽及不定芽的产生。生长素常用的是2.4-D（ 2，4-二氯苯氧乙酸）、 NAA （萘乙酸） 、 IAA （吲哚乙酸） 、 IBA （吲哚丁酸） ，它们作用的强弱顺序为2.4-D NAAIBAIAA 。它们使用的适宜浓度：IAA 以 1-10mg/L 最常用； 2.4-D 为 1-5mg/L ；NAA的适宜范围较前两者均高。在大多数情况下，只用 2.4-D 就可以成功诱导出愈伤组织，假如将 2.4-D 等生长素类物质与一种细胞分裂素一起使用时，效果会更好。 虽然 2.4-D 诱导细胞分裂较好， 但这个化合物趋向于抑制植物形态的发生，故在形态发生时很少用它（但在禾本科及某些单子叶植物的培养中，2.

20、4-D却对其器官分化有促进作用），一般多用NAA或 IBA或 IAA 与一种细胞分裂素配合使用。值得一提的是， 低浓度的2.4-D 往往有利于胚状体的分化， NAA有利于单子叶植物的分化，而IBA 诱导生根的效果最好。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 40 页名师精编优秀教案（二）细胞分裂素常用的细胞分裂素类有：激动素（KT） 、6- 苄基腺嘌呤（6-BA） 、玉米素（ ZT） 、2- 异戊烯腺嘌呤（ 2-iP ） 、吡效隆（ 4PU ，CPPU ）和噻重氮苯基脲（TDZ ） 。它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、

21、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进芽的生长及显著改变其它的激素的作用。就发挥同一生理效应的处理浓度来比较，它们作用的强弱顺序为TDZ ，4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定的而价格适中的KT和 6-BA，二者的最适浓度为1-10mg/L 。此外，赤霉素（ GA3） 、脱落酸（ ABA ）和多效唑（ PP333）等生长调节物质也见于组织培养中。六琼脂琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用。七活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利

22、用其吸附能力，减少一些有害物质的影响。例如可以防止酚类物质的污染而引起组织褐化死亡。在兰花组织培养中的效果更明显。另外， 活性炭培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质， 例如植物生长调节物质、培养宜过浓， 一般在 0.02%1.0%， 尤以 0.1%0.5%更常用。 活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚胎状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1% 4% 的活性炭，可使胚状体的发生能力得以恢复。第二节培养基的配制培养基在外植体的去分化、出芽、增殖、生根及成苗整个过程中都起着重要的作用。而培养基的选择和配制则是植物组织培养及其试管苗生

23、产中的关键环节之一。一、水和药品严格来讲， 用于配制培养基的水最好是用玻璃容器蒸馏过的去质离子的蒸馏水。所用的各种化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂，以免对培养基物造成不利影响。生长调节物质在应用前有时还需要进行重结晶或选用纯度更高的。蛋白质水解物最好是用酶水解的， 这样可以使氨基酸更好地在自然状态中保存。药品的称量及定容都要准确，不同的化学药品需要使用不同的药匙，避免药品都应随时记录称量情况（包括品名、重量等），以免重复搞错，以便于今后分析。二、母液的配制和保存配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，配成培养基配方使用浓度的 10 倍 100 倍 ，甚至 1000

24、倍。这些母液包括无机盐、维生素以及在水溶液中稳定的生精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 40 页名师精编优秀教案长调节物质等。平时应贮存在24冰箱内。待做培养基时取出，按比例稀释配用。这样每种药品称量一次，可以使用多次， 并可减少单一化合物母液；另一种是配成几中不同化合物的混合母液。 前一种方法使用配制多中培养基需要的同一种母液；后一种方法在大量配制同种培养基时省时省力。配好的母液应防在容量瓶中贮存。现以 MS 培养基为例， 在配制母液时为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中（21） ，但

25、应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。 通常把每中试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿物质说还应注意先后顺序，力求把Ca2+与 SO42-和 PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不容物。同时，要漫漫地混合，边混合边搅拌。铁盐宜单独配制，其配法为5.57g 硫酸亚铁（ FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA ）溶于 1L 水中，用时每配1L 培养基取该溶液5mL。对于植物生长调节物质，配制成母液时， 通常用 mg/ml 较为方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液， 这样的浓度既

26、便于计算也可避免冷藏时形成的结晶。由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同：IAA ，IBA 和 GA3 可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中，贴上标签后存放在冰箱中；NAA 可溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容至一定体积；2.4-D 不溶于水， 可用 1N 的 NaOH 溶解后， 再加水定容KT 和 6-BA 应先溶于少量1N 的 HCl 中，再加水定容； 玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定浓度。椰子汁的活性成分是耐热的，椰子汁从椰子中倒出后应立即煮沸过滤去除蛋白质，高压消毒后贮于 -20低温冰箱中备用。三培养基配制程序水+药品 +糖混合定容加热调节

27、 pH 值琼脂 +水加热预溶玻璃器皿及其它准备分装灭菌放冷凝固接种第三节常用培养基配方及其特点一几种常用培养基的配方（复印给学生略）二几种常用培养基的特点自 1937 年 White 建立第一个植物组织培养的培养基以来，许多研究者报道了各种植物组织培养的培养基，数量多达几十种，相信其种类还将继续增加，其中以 MS 培养基的应用最为广泛。MS 培养基是 1962 年 Murashige 和 Skoog 为培养烟草材料而设计的。特点是无机盐的浓精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 40 页名师精编优秀教案度高， 有加速愈伤组织生长

28、的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也较为合适，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用的最广泛的一种培养基。与 MS 较为接近的还有LS、RM、等培养基。与 MS 培养基相比，于1943 年设计， 1963 年作了改良的White 培养基则是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，无论是生根培养、胚胎培养还是一般组织培养都有很好的效果。B5培养基是1968 年由 Gamborg 等设计的。 它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物特别是木本植物更加适合。N6培养基是 1974年由我国的朱至清等为水稻等

29、禾谷类作物花药培养而设计的，其 KNO3和（ NH4）2SO4高且不含钼。目前在国内已广泛用于小麦、水稻及其它植物的花粉和花药的培养和其它的组织培养。SH 培养基与B5培养基相似， 不用硫酸铵而改用磷酸二氢铵，在不少单子叶和双子叶植物上使用。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 40 页名师精编优秀教案第三章外植体的选择和灭菌教学时数3 教学重点外植体的选择和外植体的灭菌方法教学难点外植体的灭菌方法教学目的要求学生在掌握无菌概念的基础上，进一步理解和掌握无菌操作的一些方法，理解在植物组织培养过程中对外植体的选择及灭菌要灵活。

30、教学方法讲解、示范、实验。除培养基成分外， 决定外植体培养成败的另一个重要因素就是外植体的来源。虽然从理论上讲，植物细胞具有全能性，能够再生新植株，因此任何器官、任何组织都可以作为外植体，但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大的差别，同时由于组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此， 在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体并进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。第一节外植体的选择一外植体的部位迄今为止组织培养获得的成功，几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓组织、表皮、块茎的贮藏薄壁组织、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠、花药等。但是不同种类的植

31、物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应是不一样的。有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分化或再分化频率很低。因此，在组织培养过程中，如何选择合适的、最易表达全能性的部位是决定组织体系成功建立的前提之一。此外，还要考虑培养材料的来源是否有保障，是否容易成苗；同时要考虑该外植体，特别是经过脱分化的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。对于大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，由于其形态已基本建成，遗传稳定，也是获得无菌苗的重要途径，但茎尖往往受材料的来源的限制，而采用茎段可解决培养材料不足的困难。由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组织培养以叶片为起始物，如玫瑰、海棠、大岩桐

32、、 矮牵牛和豆瓣绿许多植物。对一些培养较为困难的植物，则往往可以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。如有可能， 最好对培养较为困难的植物的各个部位的诱导及其分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体。二取材季节除上述取材部位外，取材季节也是重要的影响因素之一。但不同植物的取材季节要求各有不同。 对大多数植物而言，应在其生长开始的季节采样，如在生长末期或已进入休眠期时精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 40 页名师精编优秀教案取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。2-4 月，11 月至次年1 月取材培养，其成活

33、率也很低。在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖率也大。三器官的生理状态和发育年龄作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般认为， 沿植物的主轴，越向上的部分所形成的器官的生长时间越短，其生理年龄也越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。反之，越向基部，其生理年龄越小。所以植株下部组织产生营养芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高。另外，一般情况下，年幼组织比老年组织具有较高的形态发生能力。四外植体大小目前许多植物的茎尖培养表明，外植体 （茎尖） 越小成活率越低。 因此除非用去除病毒，否则不宜将外植体切的太小。但不是说外植体越大越好，外植体过大，不易彻底灭菌。第

34、二节外植体的灭菌方法一常用灭菌药剂下表时目前常用的灭菌消毒剂，其使用浓度和时间因外植体而异，需经实验确定。消毒剂使用浓度 /% 清除难易消毒时间 / 分灭菌效果次氯酸钠2 易5-30 很好次氯酸钙9-10 易5-30 很好漂白粉饱和溶液易5-30 很好升汞0.1-1 较难2-10 最好酒精70-75 易0.2-2 好过氧化氢10-12 最易5-15 好溴水1-2 易2-10 很好硝酸银1 较难5-30 好抗菌素4-50mg/L 中30-60 较好170%-75% 酒精 - 具有较强的穿透力和杀菌力，通常外植体浸入15-30 秒即可。常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能达到

35、彻底灭菌的作用，必须结合其它药剂灭菌。有时为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，提高乙醇的杀菌效果。2升汞（ HgCl2）- 是有剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白质变性，酶失活。使用浓度为0.1%-0.2%一般浸泡时间为6-12 分钟。灭菌效果极好，但其清除较难，通常用无菌水冲洗不得少于5 次。3次氯酸钠（ NaClO）- 配制 1%-10% 的次氯酸钠，灭菌时只需浸泡5-30 分钟，再用无菌水冲洗4-5 次即可。易清除，残留较少，组培中常用。其它的灭菌剂见上表。在用上述的药剂进行灭菌材料的灭菌处理时，为了使药剂浸润整个组织，

36、还需在药液中加入润湿剂。如加数滴或0.1%的吐温 80 或吐温 20。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 40 页名师精编优秀教案二外植体的灭菌方法1茎尖、茎段及叶片等的消毒植物的茎、 叶部分多暴露在空气中，易受到泥土、 肥料中的杂菌污染，消毒前需经自来水较长时间的冲洗，特别是一些多年生的木本植物材料，冲洗后还要用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗。消毒时先用75%酒精浸泡1030 秒，以无菌水冲洗2-3 遍，根据材料的不同，分别采用1%-10%的次氯酸钠溶液或0.1%的升汞浸泡8-15 分钟。如材料表面有茸毛或凹凸不平，

37、最好在消毒液中加入几滴吐温。最后在用无菌水冲洗4-5 遍方可接种。2果实和种子的消毒视果实和种子的清洁程度，先用自来水冲洗10-20 分钟， 甚至更长时间。 再用 70%酒精迅速漂洗一次。果实用 2%次氯酸钠溶液浸10 分钟， 后用无菌水冲洗2-3 次后，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则先用10%次氯酸钠溶液浸泡20-30 分钟，对难以消毒的还可用 0.1%升汞或 1%-2%溴水消毒 5 分钟。3根及地下部器官的消毒与茎叶类似。4花药的消毒通常用于组织培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，基本上处于无菌状态，故只需要将整个花蕾或幼穗消毒即可以了。一般用70%

38、酒精浸泡数秒，然后用无菌水冲洗2-3 次，再用漂白粉上清液中浸泡10 分钟，经无菌水冲洗2-3 次即可接种。三不同灭菌剂的效果差异（略）第三节污染的原因和预防措施一培养物污染的原因培养物污染的原因主要有：外植体带菌； 培养基及器皿灭菌不彻底；操作不规范等。 在组织培养实验中，污染的病原分为细菌及真菌两类。细菌污染的特点是菌斑呈粘液状物，且在接种 1-2 天即可发现， 除材料或培养基灭菌不彻底外，工作人员的不慎也是造成细菌污染的原因；真菌污染的部分长有不同颜色的霉菌，在接种 3-10 天后才能发现，真菌污染的原因多为周围环境的不清洁，超净台的过滤装置失效，培养器皿的口径过大等。二污染的预防措施1

39、培养材料的预处理；2材料内部带菌，可在培养基中加入一定量的抗生素。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 40 页名师精编优秀教案第四章外植体的接种和培养教学时数3 教学难点外植体的褐变及其防止；试管苗的玻璃化。教学重点培养条件；褐变、玻璃化的原因及防止。教学要求通过本章的教学，要求学生能够掌握接种的基本操作，能妥善处理好各培养条件的关系和防止外植体褐变及幼苗玻璃化的情况发生。教学方法讲授、示范和实验。第一节外植体的接种一接种室和净化工作台的消毒1紫外灯照射20 分钟；270%酒精喷雾空气；3台面酒精棉球擦洗；4接种时禁止谈话

40、，防止咳嗽。二外植体的接种1接种工具要经常在酒精灯上烧，防止交叉感染；2烧后的接种工具要放冷却后才能用；3操作不能离超净台边缘太近，也不能太远；4外植体应按照要求在培养基的表面或内部放好，不能让其在器皿中活动；5包扎器皿应在操作台面上进行，动作要轻，包扎好后才能从台面上移走。第二节培养方法一固体培养固体培养最常用的凝固剂是琼脂，使用浓度为0.6-1.0%（重量 /体积） 。固体培养的最大优点是简单、方便。但缺点是1）只有外植体的底部表面才能接触培养基，吸收营养，上面则不能，影响生长速度；2）外植体插入培养基后，气体交换不畅，排泄的有害物质积累，造成毒害； 3）组织受光不均匀，细胞群生长不一致。

41、二液体培养分为静止滤纸桥培养和震荡培养。第三节培养条件精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 40 页名师精编优秀教案培养条件主要包括温度、湿度、光照和pH 值等。一温度一般温度在252。通常低于15时，外植体生长出现停滞，但高于35对生长又不利。在促进芽发生时温度可略低一些。二光照光照是组织培养中的重要外界条件之一，它对外植体生长和分化有很大的影响，表现在光照、光质和光周期等方面。1有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如玉簪花芽和花茎的培养。在暗培养的条件下芽的愈伤组织诱导率较光照条件下要高，而花茎只有在暗培养的条件下才能

42、诱导出愈伤组织。有一些植物（荷兰芹）的组织培养其器官的形成不需要光，而有些植物则光可提高幼苗的分化率。一般来说，愈伤组织的诱导不需要光或需较少的光。2光质也能明显影响外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及器官的分化。如对杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。在百合株芽增殖和分化时发现，在红光下 8 周后不仅产生愈伤组织，同时也直接分化出苗，11 周后所产生的愈伤组织也分化成苗；而在蓝光下12 周后才出现愈伤组织；白光下则为未见愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。 不同的植物对光的要求不同，需不断的积累和实验才能掌握不同植物的培养规律。在一般的组织培养生产中，往往忽略光质的影响

43、。3光周期对试管苗的增殖和分化的影响，通常都选用一定的光周期来进行外植体的组织培养，如一般都选用16h 光照、 8h 黑暗。这在组织培养前应搞清该植物对光周期是否敏感。三培养基的pH 通常一般的培养基pH 值都在 5.66.0 之间。如 pH 值不适则直接影响外植体对营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官的形成。不同植物对pH 的要求不同，如兰花要求 pH 值 5.2 或更低一些，而玉米胚乳的组织培养在7.0 时愈伤组织的鲜重最快。四湿度组织培养中的湿度影响有两方面：一是培养容器内的湿度，它的湿度条件可常保持在100%；二是培养室的湿度，它的湿度变化较大。湿度过高或过低都不利于组织

44、培养。五氧和其它气体（略）精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 40 页名师精编优秀教案第四节外植体褐变及防止在组织培养中，常见到外植体由于褐变（browning ） ，产生致死性的褐化物，不仅使培养基变褐， 而且造成培养失败，它已经成为组织培养中的一个棘手问题，同时也成为植物快繁体系建立的一大障碍。可以说褐变、菌类污染、和过度含水（玻璃化）是组织培养中的三大难题，尤其是褐变。一褐变的原因很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。在完整的植株体细胞内，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。 当切割外植体后，切割

45、附近细胞的分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出，多酚氧化酶便氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停滞，最终导致死亡。二影响褐变的因素1基因型木本植物较草本植物易褐变。2外植体的生理状态一般来说随着年龄和组织木质化程度增加而褐变加强。3外植体的培养条件取材料之前进行遮光处理再切取外植体，则褐变减少，暗培养或低光照能减轻褐变。此外较低温度下培养也可适当减少褐变。4培养基：液体培养能有效减少褐变；初代培养时降低无机盐的浓度可减少褐变；6-BA 增加褐变， 2.4-D 和 NAA 减少褐变；加入抗氧化剂（硫代硫酸钠、抗坏血酸、苏糖二

46、硫醇等）可减少褐变；加入吸附剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮可减轻褐变。三防止褐变的措施1选择适宜的外植体和培养条件；2加入抗氧化剂；3加入一定的活性炭第五节试管苗的玻璃化现象及其预防措施精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 40 页名师精编优秀教案自从 1981 年 Debergh 等明确提出试植物“玻璃化”（vitrification ）概念以来，发现在很多木本和草本试管植物中都存在玻璃化现象。关于植物组织培养中玻璃苗的成因和防止方法的研究已经引起了人们的广泛注意，成为试管苗工厂化生产中亟待解决的一个问题。一玻璃苗的形态解剖与生

47、理特点玻璃苗是植物组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物，不能够移栽成活。1玻璃苗的叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状，植株矮小、肿胀，失绿，叶片皱缩呈纵向卷曲，脆弱易碎；2叶表皮缺少角质层蜡质，无功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；3体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素、木质素含量低；4组织畸形，吸收和光合作用功能不全，分化能力低，难以继代、扩大繁殖；5生根困难，难移栽成活。二玻璃苗发生的因素1有关玻璃化发生的成因研究较多。一些工作表明，玻璃化可能是培养基渗透势不当所致，即可能是培养基内部水分状态不适应的一种生理变态。有人发现琼脂和蔗糖浓度与玻璃化呈负相关，即琼脂和蔗糖浓

48、度越高，玻璃化的比例越低；也有人研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。2培养基中的激素也和玻璃化呈正相关。许多研究证明，培养基中的BA 浓度与培养温度呈正相关， BA 浓度和培养温度越高，玻璃苗比例越高。 GA3和 IAA 促进细胞过度生长，也会导致玻璃化。IAA 含量增加会加强ACC（乙烯前体）合酶的活性，促进乙烯的合成，乙烯会促进叶绿素的分解和株型肿胀，形成玻璃苗。3也有人认为，玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封口材料是导致玻璃化的原因之一。4培养基中高的含氮量，特别是高的铵态氮也是导致玻璃化的原因之一。5此外，不同部位的节段外植体也与玻璃化有关。如留兰香茎基部节段再生

49、形成的试管苗玻璃化严重，而中部茎段次之，茎尖最少；而重瓣丝石竹则相反；有时茎尖外植体的大小也与玻璃化有关。三玻璃苗发生的机理有关试管苗玻璃化的机理到目前为止仍未得出一致得看法。1张洪胜认为乙烯对玻璃苗的形成起启动作用；但张昆瑜等在香石竹的培养基中添加ACC 和乙烯利（乙烯释放剂）则有利于蛋白质的合成和干物质的含量，有利于组织器官发育。可见乙烯对玻璃苗作用的是较为复杂的。2李云等发现植物磷酸戊糖（HMP ）途径与玻璃苗的产生有关。密封瓶口、高温、高精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 40 页名师精编优秀教案浓度细胞分裂素等因

50、子加快生长速度，增加了瓶中CO2 浓度，于是抑制HMP 进程，核酸、蛋白质、纤维素等合成就减少。四控制和克服玻璃苗的措施1适当提高培养基的蔗糖含量或加入渗透剂，减少培养基中水分对试管苗的胁迫；2适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度，降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量；3增加自然光照。自然光中的紫外线能促进试管苗的成熟加快木质化，减少玻璃化。控制温度，防止玻璃化。4改善培养器皿的透气状况；5培养基中添加其它物质。如间苯三酚或根皮苷、矮壮素、土豆汁、青霉素（40 万U/L ）等在不同的组织培养中均有一定的效果。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - -