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1、.实验四、土壤中放线菌的分离一、实验目的1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富，品种齐全。通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其
2、它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原
3、理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。图1 稀释涂平板法示意图四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。五、实验条件试剂与仪器试剂：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO43H2O、NaCl、FeSO47H2O、MgSO47H2O、琼脂、盐酸、氢氧化钠、pH 试纸、重铬酸钾仪器：微波炉
4、、电磁炉、干燥箱、50 或100mL 量筒（灭菌）、玻璃涂铲（灭菌）、90mm 培养皿（灭菌）、250ml三角瓶（灭菌）、1 或 2mL 移液管（灭菌）、试管（灭菌）、小玻璃珠（灭菌）、标签纸、洗耳球。培养基：高氏1号合成培养基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO43H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，MgSO47H2O 0.5 g，pH:7.2-7.4，琼脂20 g，水1000 mL，分装，高压湿热灭菌。培养基制备过程：称取一定量可溶性淀粉，放入装有少量水的小烧杯中，用玻棒将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性
5、淀粉完全溶化。再称取其他各成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在10ml 水中加入0.1g 的FeSO47H2O 配成0.01g/ml 母液，再在1000ml培养基中加入1ml的0.01g/ml 的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，调节pH、分装、包扎、湿热灭菌。土样：从校园各处采样。要求学生到不同生境、不同深度土壤中取样，如：塘泥、森林、苗圃、路边菜园土或林地土，适量、自然风干，待用。六、实验步骤土样基本处理：每处理随机取不同土壤约100 g，自然条件下风干，颜色由深变浅后碾碎，过孔径为840 m（20 目）的土壤筛（或
6、人工挑取较大的石粒或土块）。用无菌的报纸将土样包好（单层），放到电热鼓风干燥箱中，60干热处理1h。（教师在课堂讲授前先指导学生完成该步骤的实验）倒平板：将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热溶解（视情况定加热时间，注意掌握好加热的时间）、冷却后倒平板，每皿约20 mL。待充分冷却后用于涂布。称取待测样品10.0 g（盛放于灭菌纸中），放入装有90 mL 无菌水的250 mL 三角瓶中，充分振荡10 min，即配成10-1 稀释度的土悬液；用移液管量取1mL 稀释度为10-1 的土壤悬浮液于装有9mL 无菌水的试管中，充分振荡，即配成10-2 稀释度的土壤悬浮液，按此法依次配
7、成10-3，10-4 稀释度的悬浮液。用平板表面成菌落法测定土壤中微生物数量。将配好不同稀释度（10-2，10-3，10-4）的菌悬液，用无菌移液管吸取0.2 mL 土壤悬液接种在不同的稀释度编号的平板上，每个处理重复2 次，用无菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每个稀释度用一个刮铲，如果从低浓度到高浓度涂布，可不用换刮铲。将涂好的平板置于操作台面上2030 min，使菌液充分渗透于培养基内，然后将平板倒放，置于28 条件下恒温培养至长出菌落开始计数，观察。每组在每个浓度两个平板分两种处理：一组无需向高氏一号培养基中加入0.5 重铬酸钾溶液，直接置于微波炉中加热溶解、冷却后倒平板；另一组需向已加热
8、溶解并冷却至60高氏一号培养基中加入1.5 mL 0.5%重铬酸钾溶液，充分摇匀后倒平板。七、作业实验记录一、土样处理步骤 （将之前得到的土样60干热处理1h拿到称取待测样品10.0 g） （将土样溶解溶于250 mL 三角瓶中无菌水中，变浑浊，即得10-1 稀释度的土悬液）(将10-1稀释度的土悬液稀释成 10-2 、10-3 、10-4稀释度的土悬液，颜色随浓度降低变浅 )二 倒平板步骤倒平板前的实验处理将装有灭好菌的高氏一号培养基的三角瓶直接置于微波炉中加热溶解（微波炉中加热溶解）冷却后倒平板，每皿约20 mL。（准备十二个平板用于分两组处理情况，一组六个 每一个浓度四个处理。一组为无重
9、铬酸钾处理 一组为添加了重铬酸钾1.5 mL 0.5%）倒平板步骤将配好不同稀释度（10-2，10-3，10-4）的菌悬液，用无菌移液管吸取0.2 mL 土壤悬液接种在不同的稀释度编号的平板上，每个处理重复2 次用无菌刮铲将菌液在平板上均匀涂开，每个稀释度用一个刮铲（涂布，将不同稀释度的悬浮液涂布到平板上）将涂好的平板置于操作台面上2030 min，使菌液充分渗透于培养基内然后将平板倒放，置于28 条件下恒温培养3天至长出菌落开始计数，观察三土壤中（湿重）放线菌的数量及培养的特征描述（有重铬酸钾10-2 稀释度）（无重铬酸钾 10-2 ）（有重铬酸钾10-3 稀释度）（无重铬酸钾10-3 稀释
10、度）（无重铬酸钾10-4 稀释度）（有重铬酸钾10-4 稀释度）分析与描述1数量土壤浓度越高的培养基中放线菌的数量越多，其中中等浓度的放线菌长势最好，而且数量大约是随着浓度梯度呈现成倍增加。2外观与干燥度放线菌的菌落质地紧密，表面呈紧密的绒状，或者坚实，干燥且不易挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈现絮状或者颗粒状。3无重铬酸钾的培养基 中除放线菌以外还有其他类型细菌的菌落，呈现絮状 外观为浅黄色的八、注意事项添加重铬酸钾要适量；注意涂平板的方法；3 天和5 天后请记录观察实验结果。九、结果记录与分析取平均数菌液稀释度放线菌个数/（有重铬酸钾）放线菌个数/
11、（无重铬酸钾）10-260035010-328018010-41020分析1高氏培养基的配制关键是PH值得调节和重铬酸钾的加入，放线菌最适生长的温度是在2327都 PH是7.07.5.而在同样的条件下也有利于霉菌的生长。在高温条件下，放线菌和霉菌都不能被完全杀死，仍可以存活，加入重铬酸钾可以抑制霉菌和细菌的生长，而对放线菌不抑制。分析2整个环境要在无菌的条件下进行 ，培养基以及实验过程使用的刮铲，报纸等等要经过灭菌处理。接种是在火焰区的无菌范围内操作，且打开培养基的时间要控制好，补课过长。分析3稀释倒平板法涂布是要均匀，否则，细菌密度不均将导致菌落生长过于集中，细菌可能无法充分利用营养成分影响细菌生长，且在鉴别是比较难看到明显的抑菌圈。分析4从实验得到的培养基中科院看到，可能存在操作上的小误差，培养基还有轻微的污染，可能的原因是中倒平板是没有完全在火焰区操作，导致的误差。Shi li da ma lao lao shi shi zi ji xie shi yan bao gao