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1、第1章 微生物工程概论微生物工程主体是利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业产品或转化物质等。微生物工程需要微生物学、生物化学、化学工程学和市场营销学等有关知识。已成为微生物学、生物化学和化学工程学等多学科密切相关的交叉性学科。5 在农业中的应用生物农药生物农药生物除草剂生物除草剂生物增产剂生物增产剂食用菌和药用真菌食用菌和药用真菌肥料肥料6 在环境保护中的应用厌气处理法厌气处理法好气处理法好气处理法7 在其它方面的应用在其它方面的应用在细菌冶金中的应用在细菌冶金中的应用医学诊断医学诊断生物传感器生物传感器第第2章章 菌种的来源菌种的来源标本采集标本采集标本预处理标本预处理菌种
2、的分离菌种的分离一、菌种分离的一般过程样本的采取样本的采取 预处理预处理 富集培养富集培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题： 自然界中有目的微生物分离的原则二、采样时要注意的问题l 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：l 定向培养定向培养: :采用特定
3、的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养；条件，进行培养；三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑；类学中考虑；l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法。时只能通过随机分离的办法。定向培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等物理方法：加热、膜过滤等但主要是通过培养的方法但主要是通过培养的方法定向培养的富
4、集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度采用一切能提高目的微生物相对生长采用一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占批连续）后使目的微生物在种群中占优势。优势。四、菌落的选出四、菌落的选出q 从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，
5、是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。第第4章章 优良菌种选育优良菌种选育 优良的生产菌种应该具备如下的基本特性：优良的生产菌种应该具备如下的基本特性：具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。在发酵过程中不产生或少产生副产物。在发酵过程中不产生或少产生副产物。生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产抱子能力。该具有较强的产抱子能力。能够高效地将
6、原料转化为产物。能够高效地将原料转化为产物。有利用广泛来源原材料的能力，并对发酵原料成分的波动有利用广泛来源原材料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较小。敏感性较小。对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。物质作为一般碳源利用。在发酵过程中产生的泡沫要少。在发酵过程中产生的泡沫要少。具有抗噬菌体感染的能力。具有抗噬菌体感染的能力。遗传特性稳定。遗传特性稳定。 菌株选育目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退
7、化方法基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错点突变、易错PCR、同序法、同序法DNA Shuffling等等菌株选育3.1自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。互变异构效应引起自然突变的几率为109108。 突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。 为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，
8、选出优良的菌种。自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。重要措施。回复突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变突变问题：问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细
9、胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验3.2诱变选育用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍（一）、诱变育种（一）、诱变育种（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使
10、用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（三三）、筛选的方法）、筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。些特性，称为遗传标记。结构类似物结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终物）相似，因而在代谢调节方面可
11、以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。3.3 杂交育种杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物质进行交换重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中。通过杂交可以扩大变异范围，改变产品的产量和质量，甚至创造出新品种。 细菌的杂交育种 放线菌的杂交育种 霉菌的杂交育种1.酵母的杂交育种3.4 原生质体融合技术原生质体融合技术原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法。原生质体融合的方法是首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗环境中释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场作用下，使它们互相凝集，发生细胞融合，实现遗传重
12、组。主要应用：1.用于选育高产优质菌株2.用于产生新的产物3.4.1 原生质体融合的优越性原生质体融合的优越性受接合型或致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交。重组频率高于其他杂交方法。遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。3.4.2 原生质体融合方法1. 原生质体制备：使用各种酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，使其细胞壁全部消化或部分破裂，释放出原生质体。2. 原生质体融合和再生：两个出发菌株制备好的原生质
13、体可以通过化学因子或电场诱导的方法进行融合。融合后的原生质体具有生物活性，但由于缺少细胞壁，不能在普通培养基上生长。所以要涂布在高渗培养基上令其再生，可以增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖来增加再生率。3. 融合子的检出：融合子是在选择性培养基上检出的，即通过两个遗传标记互补确定的。3.5 基因工程技术将外源DNA通过体外重组后，导入受体细胞，使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或DNA体外重组技术。 基因工程菌制备的主要程序包括：目的基因的克隆，DNA重组体的体外构建，重组DNA导入宿主细胞，基因工程菌的选择。对工业生产有重要意义评价指标：基因的表达产量，表达产物的稳定性，产
14、物的生物活性，产物的分离纯化。1 基因表达系统基因表达系统基因的表达系统分两大类：基因的表达系统分两大类：原核表达系统：原核表达系统：大肠杆菌大肠杆菌。由于大肠杆菌生长繁殖迅速，对其的分子遗传学研究比较深入，它是基因工程中最常采用的原核表达系统。大肠杆菌因本身的特点，其基因工程表达产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数情况下还可分泌到细胞外表达。枯草芽抱杆菌枯草芽抱杆菌。枯草芽抱杆菌分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到胞外，不形成包含体。链霉菌链霉菌。链霉菌作为外源基因表达系统有着不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物分泌到胞外，具有糖基
15、化能力等特点。 真核生物表达系统：真核生物表达系统：酵母菌酵母菌。酵母菌是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，其基因组较小，世代周期短，有单倍体、双倍体两种形式。酵母菌生长迅速，易培育，不产生有毒物质，基因工程操作方便，与原核生物相似，表达产物能够糖基化，因而被认为是表达外源蛋白质的最适表达系统。现已在酵母中成功地建立了几种有分泌功能的表达系统，能够将表达产物直接分泌至胞外。在各种酵母中，以酿酒酵母的研究和应用最为广泛。目前已有不少真核基因在酵母中成功地表达，如干扰素、乙肝表面抗原基因等。 丝状真菌丝状真菌。丝状真的特点是有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化等。糖基化方式与高等真核生物相似。丝状真菌（如曲霉等）是安全菌株，并有成熟的发酵和后加工工艺。