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1、v一 实验目的v1掌握谷氨酸发酵的原理及发酵过程的控制和操作v2掌握培养基的配制和灭菌的基本技术、谷氨酸菌种制备及种 子扩大培养。v3了解用等电法从发酵液回收谷氨酸的方法。v4掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。 二 实验原理v味精,也称味素,因味精起源于小麦,俗称麸酸钠、谷氨酸钠（分子式C5H8NO4Na ）。谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖经糖酵解（EMP）和单磷酸己糖途径（HMP）生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定作用生成草酰乙酸，两者合成柠檬酸进入三羧酸循环（TCA循环），由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸在谷氨
2、酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，要在培养基中添加亚适量（浓度应在5g/L左右）生物素维持细胞正常生长和控制细胞膜的透性达到高产谷氨酸的目的。回收的谷氨酸又称麸酸，并无鲜味，将其进行中和精制得到味精。v3）发酵工艺条件v采用火焰接种法接种，接种量10%v罐压控制在0.05MPav转速200750r/min，调节转速及通气量控制溶氧在20%以上v当pH降到7.07.1左右，及时流加尿素（氨水）。 前期pH7.58.0， 中期降到7.17.4，后期7.0，在发酵结束前6小时停止流加尿素（氨水） ，接近放罐时pH约6.56.8 温度：0-5h 34；5-1
3、0h 35；10-18h 36；18h26h 37；26h后37vOD净增控制: 总OD=0.750.8。v残糖浓度通过流加葡萄糖液（残糖在5%2.0%时是流加糖最佳时机）控制在10-15g/L。发酵周期在36h内，放罐时残糖应低于5g/L。流加糖占总投糖的 60%70%时产酸和转化率较为理想。开始流加时机应以残糖量、耗糖速度、菌体的活力和转型情况为依据 v泡沫控制：在发酵产生一定泡沫时，流加一定量的消泡剂，每次流加约40g/m3 。v4）放罐v发酵结束后，将发酵液加热至80维持15min灭菌，并清洗发酵罐及补料瓶。v从发酵4小时开始，每间隔2小时测定OD，pH，糖含量，镜检v3-2 发酵培养
4、摇瓶发酵摇瓶发酵v取种子培养液以10%接种量接种至装有25mL发酵培养基的500mL三角瓶中，8层纱布封口，置巡回式摇床(220r/min)上振荡培养 36h。添加 2滴1%苯酚红指示剂，间歇流40加尿素控制 pH 在 7.0 左右。温度：前期3233，后期3437 。转速：前期100rmin，后期220r/min。发酵过程参数测定幻灯片 9还原糖的测定谷氨酸的测定菌体形态观察菌体浓度测定发酵过程参数的控制DO值pH温度搅拌速度发 酵发 酵 液冷却接种三角瓶培养固体斜面培养上罐实消培养基的配制谷氨酸发酵的工艺流程简图谷氨酸发酵的工艺流程简图6 谷氨酸的提取与分离谷氨酸的提取与分离等电点法提取工
5、艺等电点法提取工艺操作简单，收率60。周期长，占地面积大 晶种 4h 发酵液发酵液菌体分离菌体分离清液（浓缩）清液（浓缩） 育晶点育晶点停酸搅拌两小时停酸搅拌两小时边冷却边缓慢调酸边冷却边缓慢调酸 2M HCL 等电点等电点低速低速搅拌搅拌结晶结晶68h 4静置沉降静置沉降4h湿谷氨酸湿谷氨酸离心分离离心分离谷氨酸谷氨酸 母液母液1)发酵液预处理采用金属过滤膜过滤设备去除菌体及固形物杂质，必要时可在膜过滤前添加絮凝剂沉淀蛋白质杂质，添加发酵液体积1.5%的粉末活性炭在80下对发酵液脱色20min，在510nm下透光值达到75%以上。v2）发酵液浓缩v采用旋转蒸发仪70、-0.1 MPa真空度下
6、浓缩发酵液体积至原体积的50%。v3）等点结晶v采用2M HCL调节谷氨酸浓缩液pH至3.2，并缓慢搅拌育晶8hv4）晶体分离及干燥v采用真空抽滤设备分离谷氨酸晶体，60烘干并称重。7 谷氨酸制味精谷氨酸制味精谷氨酸用适量的NaCO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤、最终制成味精。工艺条件：湿谷氨酸：水：纯碱：活性炭工艺条件：湿谷氨酸：水：纯碱：活性炭=1：2：（：（0。30.34）：）：0.01v 1）在不锈钢内桶内加入清水及活性炭升温到65 ，开始搅拌60r/min。投入谷氨酸，成为饱和溶液。2）缓慢逐步加入NaCO3 中和到pH6.4（试纸），加热到65 ，继续搅拌4）谷氨酸
7、钠的浓缩结晶：a.将澄清的脱色液（18-20B/35 ）加到旋转式蒸发仪（加料1/2）,真空度80kPa以上，T70 浓缩至3434.5 B/80 ，升温至80 放料。放料后冷却，搅拌23h后开冷却水降温，降温到（室温+15 ） b.分离 ：抽滤（工业滤布作介质/真空抽滤设备 ）c.烘干：鼓风干燥箱（T60 ）干燥。即可得到味精原粉。注 中和液除铁、除锌：硫化钠法、树脂法除铁锌。 五 注意事项 1菌种制备的整个过程牢固无菌概念，严防杂菌污染。v2流加糖消毒灭菌温度不宜过高，切要迅速降温至3045 ， 105 在搅拌以防止糖液的焦化产生焦糖和色素,流加过程中残糖控制量不宜忽高忽低。v3等电点法提
8、取谷氨酸注意A、发酵液纯度高：谷氨酸/残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好； B、发酵液处理要及时；C、加酸调pH、温度、育晶时间、搅拌服从结晶规律，特别是观察到晶体后，要停搅拌2h 育晶，否则产物无法沉淀。D谷氨酸结晶操作中要控制条件，避免型结晶析出。v4中和使用NaCO3，在pH7左右得到谷氨酸一钠，在pH9-10得到的是谷氨酸二钠，因此中和应严格控制反应的pH。v5注意配料顺序：硫酸镁和磷酸氢二钾应分别溶解，交叉加入 v六实验数据处理方法v1）菌体OD ：吸取0.5ml发酵液，加入9.5ml水稀释并摇匀，采用7200分光光度计于600nm下（752型620nm）测定吸光值。v2）pH值:在
9、线测定v3）还原糖含量:用裴林试剂测定v4）镜检：每隔6小时检测菌体的生长状况，要求无杂菌和噬菌体。v5） GA含量：从发酵12小时开始，每隔4小时测定GA含量，GA用茚三酮比色法测定。v6）糖酸转化率v发酵液中生成的谷氨酸量和消耗的葡萄糖质量的比例。转化率=VtGA%/V0初糖%(Vt 发酵放罐体积;V0 初始定容体积)v七实验结果分析七实验结果分析v1 实验过程中每间隔2h取样一次，分别测定还原糖、溶氧、通气量、PH、菌体浓度、谷氨酸含量等指标的过程曲线，绘制谷氨酸发酵过程曲线图，并解释曲线变化的原因。v2、计算谷氨酸产量、糖酸转化率、谷氨酸提取收率等指标；以发酵零小时的投入糖量除以发酵终
10、了的谷氨酸总质量，得到谷氨酸的转化率。v3比较各小组实验结果，评价本小组谷氨酸发酵及味精制作的结果，总结实验过程中的得与失。v4根据所得产量，分析影响味精产量的因素。v八八 思考题思考题v1为什么以尿素为氮源的发酵控制中，增加风量和提高溶氧会造成发酵液PH的上升？v2以谷氨酸发酵过程中pH值的变化规律为例，说明为什么pH值的变化是反应过程中菌体生长和产物合成的综合性指标？v3发酵过程实现高的产酸，应如何防止杂菌及噬菌体感染？ v主要参考文献v发酵工程实验指导 吴根福 主编 高等教育出版社 2006.5ISBN7-04-018619-5v生物工程专业实验 贾世儒 主编 中国轻工业出版社 2004
11、.7 ISBN7-5019-4390-7v固定化原生质体半连续发酵生产谷氨酸 文章编号0254-5071（2010） 06-0121-02 v 缪静 冯志彬 呈显好 张玉香 程仕伟 张健勇vIntnert 谢谢 ！v缓冲 溶 液 的 制 备 : 配 制p H 6 . 0 的NaAc - HAc 缓冲溶液。v谷氨酸标准液的配制:用天平准确称取1. 0000g谷氨酸标准品,溶于 1L 缓冲溶液中。v再采用逐级稀释法配得浓度为 80 g/ mL、90 g/ mL至140 g/ mL 的谷氨酸标准液。v茚三酮试剂的制备:称取 0. 5g 茚三酮溶于 100mL 水中得到 5g/ L 的茚三酮水溶液。v
12、1 实验方法v2 标准曲线的确定v分别吸取 80140g/ mL 的谷氨酸标准液 5mL 于 25mL 的比色管中 ,各加入 1mLv的茚三酮试剂 ,加上塞充分摇匀。将其置于90 下水浴 2025 min ,冷却至室温 ,用v7200 型分光光度计在 569nm 下测得其光密度值2 。以标准液的光密度值和浓度做一标v准曲线。v3 样品的测定v稀释待测液于 80140g/ mL 内(谷氨酸发酵液浓度一般在 8 %14 % ,测量时稀释1000 倍即可) ,调p H 为6. 0。以同样的反应量与反应条件进行反应 ,并在 569nm 下测定其光密度值。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓度 ,再乘以稀释倍数即为谷氨酸待测液的浓度。25 结束语结束语