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1、问题讨论问题讨论 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，使用烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，使用他人皮肤来源不足，而且会产生排斥反他人皮肤来源不足，而且会产生排斥反应。请同学们想一想如何来治疗该病人？应。请同学们想一想如何来治疗该病人？取该患者的皮肤进行细胞培养取该患者的皮肤进行细胞培养, ,获得足获得足量的细胞后再移植量的细胞后再移植动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植技术核移植技术动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术(
2、(基础技术基础技术) )动动物物细细胞胞培培养养动动物物细细胞胞培培养养 细胞在贴壁生长细胞在贴壁生长过程中过程中, ,随着细胞分随着细胞分裂裂, ,数量不断增加数量不断增加, ,最后形成单层细胞最后形成单层细胞, ,此时细胞间相互接此时细胞间相互接触触, ,细胞分裂和生长细胞分裂和生长停止。停止。接触抑制接触抑制细胞贴壁现象细胞贴壁现象思考题思考题2.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？3.如何将动物组织分散成单个的细胞呢？如何将动物组织分散成单个的细胞呢？4.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说
3、明细胞间的物质是什么成份？质是什么成份？成块的组织细胞靠在一起成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和彼此限制了细胞的生长和增殖增殖先用剪刀剪碎先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶处理后用胰蛋白酶处理胰蛋白酶水解蛋白质胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质细胞间的成份是蛋白质1.动物细胞培养取材时，一般是取动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动胚胎组织或幼龄动物的组织或器官物的组织或器官，请解释原因？，请解释原因？胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛5.胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？为什么？6.既然胰蛋白酶能将
4、细胞消化掉，那将动物组织分散既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？成单个细胞要注意什么问题呢？7.能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用。的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用。注意必须控制好胰蛋白酶的消化时间注意必须控制好胰蛋白酶的消化时间不能。胃蛋白酶作用的适宜不能。胃蛋白酶作用的适宜pH约为约为2，当，当pH大于大于6时，时，胃蛋白酶就会失去活性。而多数动物细胞培养的适胃蛋白酶就会失去
5、活性。而多数动物细胞培养的适宜宜pH为为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。，胃蛋白酶在此环境中没有活性。8.动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？9.培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。10.如何理解原代培养和传代培养？如何理解原代培养和传代培养？上述过程中，在第一培养瓶中
6、培养就是原代培养，上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养11.人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？10代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。代以内的细胞，以保持细胞正常的二倍体核型。因为因为1050代部分细胞的细胞核型可能发生变化，代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展有少部分还发生突变向癌细胞方向发展多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识
7、，思考以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子和动物血清等。长因子和动物血清等。适宜温度、适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境动物细胞培养条件：动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 添加一定量的抗生素，定期更换培养液添加一定量的抗生素，定期更换培养液2、营养、营养 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等3、温
8、度和、温度和pH 36.50.5度度, 7.27.44、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5% CO2 ）保证细胞顺利的保证细胞顺利的生长增殖生长增殖防止培养过程中防止培养过程中的污染的污染清除代谢产物，防止细清除代谢产物，防止细胞内代谢产物积累对细胞内代谢产物积累对细胞自身造成危害胞自身造成危害维持培养液的维持培养液的pH动物细胞培养的应用动物细胞培养的应用1.1.大规模生产生物制品（病毒疫苗、大规模生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）干扰素、单克隆抗体）2.2.获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮3.3.培养的动物细胞可以用于检测
9、有毒培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性物质，判断某种物质的毒性4.4.为治疗和预防癌症及其他疾病提供理为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据论依据5.5.为基因工程提供受体细胞。为基因工程提供受体细胞。比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的植物体植物体细胞株、细胞细胞株、细胞系系快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等获得细胞或获得细胞或细胞产物细胞产物蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清固体培养基固体培养基液体培养液体培养基
10、基细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖克隆克隆1、什么是克隆、什么是克隆?2、以前学习过动物克隆的实例吗？、以前学习过动物克隆的实例吗？3、请简述多莉克隆的过程？、请简述多莉克隆的过程？多莉羊多莉羊卵细胞卵细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育过程多莉羊的培育过程融合后的卵细胞融合后的卵细胞、动物的克隆与植物克隆一样吗？、动物的克隆与植物克隆一样吗？、用动物体细胞进行克隆的过程、用动物体细胞进行克隆的过程,其其实际操作过程是什么？实际操作过
11、程是什么？动物克隆过程的实际是动物克隆过程的实际是细胞核移植细胞核移植不一样不一样、阅读课本、阅读课本P48，简述高产牛体，简述高产牛体细胞核移植过程细胞核移植过程1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质最为使核移植的胚胎或动物的遗传物质最大程度来自有重要利用价值的动物提供的大程度来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉
12、或将其破坏。或将其破坏。培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至1050代代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。代以内的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，
13、想一想，这是为什么？3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？绝大部分绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有来自于供体细胞核，但其核外还有少量的少量的DNA，即，即线粒体线粒体DNA是来自于受体卵母细胞。是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全体动
14、物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。的复制。动动物物体体细细胞胞核核移移植植1.克隆动物作为克隆动物作为生物反应器，生生物反应器，生产医用蛋白产医用蛋白2.改良动物品种改良动物品种 3.治疗人类疾病，治疗人类疾病，作为供体作为供体4.保护濒危动物保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题许多克隆动物许多克隆动物表现出遗传和表现出遗传和生理缺陷，如生理缺陷，如体型过大，异
15、体型过大，异常肥胖，发育常肥胖，发育困难，脏器缺困难，脏器缺陷，免疫失调陷，免疫失调等。等。动物细胞细胞核移植技术中的动物细胞细胞核移植技术中的3个易错点个易错点1 1、动物细胞核移植技术，体现了动物细胞核的、动物细胞核移植技术，体现了动物细胞核的全能性而非细胞的全能性。全能性而非细胞的全能性。2 2、克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝、克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大叔性状与供核亲本一致。大叔性状与供核亲本一致。3 3、核移植技术获得的动物与供体动物性状不完、核移植技术获得的动物与供体动物性状不完全相同的原因：全相同的原因： 克隆动物线粒体中的克隆动物线粒体中的DNADNA来自去
16、核卵母细胞；来自去核卵母细胞； 性状受环境的影响；性状受环境的影响； 在个体发育过程中有可能发生基因突变。在个体发育过程中有可能发生基因突变。1 1、概念、概念：也称：也称_，是指两个或多个，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的_细胞，称为杂交细胞。细胞，称为杂交细胞。2 2、原理、原理：动物细胞融合与植物原生质体融合的：动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，都是磷脂分子重新排布。基本原理相同，都是磷脂分子重新排布。细胞杂交细胞杂交单核单核细胞细胞A A细胞
17、细胞B B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法：电激物理法：电激化学法：化学法：PEGPEG仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒3 3、诱导方式、诱导方式物理方法：物理方法：振动、离心、电激振动、离心、电激化学方法：化学方法：聚乙二醇聚乙二醇(PEG)4 4、过程、过程灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞细胞膜具有一定的流动性）细胞膜具有一定的流动性）5 5、意义：、意义： 细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使细胞融合技术突破了有性杂交方法的
18、局限，使_成为可能。至今种间、属间、科间，甚成为可能。至今种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用细胞融合生物新品种培育等的重要手段。特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造_开开辟了新途径。辟了新途径。远缘杂交远缘杂交单克隆抗体单克隆抗体1 1传统抗体的获得传统抗体的获得(1)(1)方法：向动物体内反复注射某种方法：向动物体内反复注射某种_，使
19、，使动物产生抗体；从动物血清中分离所需动物产生抗体；从动物血清中分离所需_。(2)(2)特点：特点：_、纯度低、纯度低、_。抗原抗原抗体抗体产量低产量低特异性差特异性差传统抗体是传统抗体是多多克隆抗体克隆抗体B1B2B312细菌细菌3杂交瘤细胞杂交瘤细胞注射特定蛋注射特定蛋白免疫小鼠白免疫小鼠培养小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（A A）多种细胞多种细胞多种杂交瘤细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞选择培养基筛选选择培养基筛选克隆化培养克隆化培养专一抗体检测专一抗体检测注射到小鼠注射到小鼠腹腔内增殖腹腔内增殖体外培养
20、体外培养单克隆抗体单克隆抗体融合融合4 4单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用(1)(1)优点：优点：_、_、产量大。、产量大。(2)(2)应用：应用：作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。快速的优点。用于用于_和和_。特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高治疗疾病治疗疾病运载药物运载药物抗抗（人绒毛膜促性腺激素）（人绒毛膜促性腺激素）单克隆单克隆抗体抗体 在受精后不久，胎盘滋在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌养层细胞就会分泌人绒毛膜人绒毛膜促性腺激素促性腺激素(HCG)(HCG)，是由受孕，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激
21、素，在孕妇的尿液蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。女尿液中几乎不含有。ABAB1 1、ABAB2 2、ABAB3 3 。专一抗体检验阳性：有限稀释法多孔细胞培养板多孔细胞培养板抗体检测板抗体检测板 思考思考1 1：一种细菌进入实验动物内环境后，为什么会有多种：一种细菌进入实验动物内环境后，为什么会有多种B B淋巴细胞都能特异性识别该细菌？淋巴细胞都能特异性识别该细菌？ 分析：细菌表面有多种糖蛋白分子（如图中的分析：细菌表面有多种糖蛋白分子（如图中的123123）都可以）都可以作为作为_刺激实验动物的刺激实验动物的B B淋巴细胞，而一种淋
22、巴细胞，而一种B B淋巴细胞只识别淋巴细胞只识别细菌表面的细菌表面的_并产生一种对应的抗体。因此实并产生一种对应的抗体。因此实验动物血液中会出现验动物血液中会出现_种针对该细菌的抗体，但每一种抗体种针对该细菌的抗体，但每一种抗体只能特异性的和细菌表面的一种只能特异性的和细菌表面的一种_结合。结合。 思考思考2 2：为什么会出现未融合的细胞和融合的具有同种核的：为什么会出现未融合的细胞和融合的具有同种核的细胞？细胞？分析：分析：_。抗原抗原一种特定的糖蛋白一种特定的糖蛋白多多特异的糖蛋白分子特异的糖蛋白分子因为融合的成功率不是百分之一百，并且融合是随机的因为融合的成功率不是百分之一百，并且融合是
23、随机的 思考思考4 4：融合的杂交瘤细胞是一种吗？为什么？：融合的杂交瘤细胞是一种吗？为什么？ 分析：是多种，因为从小鼠脾脏中分离的分析：是多种，因为从小鼠脾脏中分离的_是多种。是多种。 思考思考5 5：如何从多种杂交瘤细胞中选出我们需要的那种？：如何从多种杂交瘤细胞中选出我们需要的那种？ 分析：通常用有限稀释法，其原理是：将杂交瘤细胞培分析：通常用有限稀释法，其原理是：将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔 里 就 可 能 只 有孔 里 就 可 能 只 有 1 1 个 杂 交 瘤 细 胞 ， 培 养 之 后 ，
24、 用个 杂 交 瘤 细 胞 ， 培 养 之 后 ， 用_等检测每个小孔上清液里是否含有我们需要等检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的特异性的抗体。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。B B淋巴细胞淋巴细胞标记的抗原标记的抗原 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案风杆菌的实验方案2 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过
25、程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3 3、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5 5、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨
26、髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC练一练练一练A A 、 B B细胞为动物细胞细胞为动物细胞, ,请据图回答问题请据图回答问题: :A细胞细胞B细胞细胞C细细胞胞D细细胞胞(1)(1)若若A A细胞为骨髓瘤细胞细胞为骨髓瘤细胞B B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细胞, ,那么那么D D细胞细胞称为称为 细胞细胞,D,D细胞具有两个亲本细胞的细胞具有两个亲本细胞的特征特征, ,一方面因具有骨髓瘤细胞的一方面因具有骨髓瘤细胞的 性性质质, ,通过通过 方式产生大量细胞方式产生大量细胞, ,我们称之我们称之为为 过程过程; ;另一方面能分泌大量的抗
27、体另一方面能分泌大量的抗体, ,我我们把该过程分泌的抗体称们把该过程分泌的抗体称 . .杂交瘤杂交瘤连续分裂连续分裂有丝分裂有丝分裂单克隆单克隆单克隆抗体单克隆抗体练一练练一练(2)D(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 , ,合成该物质的场所是合成该物质的场所是 , ,它是由它是由 控制合成的控制合成的, ,合成过程包括合成过程包括 和和 两个重要步骤两个重要步骤. .球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转录转录翻译翻译(3)D(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用, ,与血清抗体相比其优越之处在于与血清抗体相比其优越之处在于 强强 高高. .免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)(4)若若A A为人细胞为人细胞,B,B为鼠细胞为鼠细胞, ,用同位素标记用同位素标记A A细胞膜细胞膜上的蛋白质上的蛋白质,B,B不标记不标记, ,在在C C细胞时细胞时, ,检测结果发现整个检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有细胞一半有放射性另一半没有. .在在D D细胞时细胞时, ,检测结果检测结果发现整个细胞都有放射性发现整个细胞都有放射性, ,请解释原请解释原因因 . .构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动