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1、生物下游技术重点总结：第二章：为什么要进行发酵液预处理？处理的目标及内容分别是什么？最终目的就是要有利于后续的分离纯化的进行，因为发酵液中黏性大，固体颗粒多复杂，目标产物在发酵液中浓度非常低，必须通过一系列的处理才行发酵液金属离子的去除方法分别有哪些？杂蛋白去除的方法和机理分别是什么？草酸处理钙离子和镁离子生成草酸钙和草酸镁，三额离聚磷酸钠处理镁离子形成络合物，黄血盐处理铁离子产生普鲁士沉淀等。杂蛋白去除的方法有等电点法 ，有机溶剂法，加热法，盐析法 ，吸附法，其他分离法等。发酵液处理性能的改善有哪些方法？降低黏度，可以用加热和稀释法；调节PH；调节温度；絮凝处理等絮凝和凝聚的概念、机理分别是
2、什么？絮凝是指高分子的絮凝剂的作用下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝颗粒的过程，这是一种以物理集合为主的过程凝聚是指在中性盐的作用下，双电层的排斥点位下降，使胶体体系不稳定的，使微粒相互黏在一起的现象有哪些絮凝剂可以使用？高聚物、无机盐、有机溶剂和表面活性剂第七章液相色谱：液相色谱： 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。用液体作为流动相的色谱法。色谱法的原理：1、色谱法是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法；2、试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程；3、其中的一相固
3、定不动，称为固定相 ；4、另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为 流动相5、当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出；6、 与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。7、两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础色谱的一般过程：A 色谱柱 (column)：B 固定相 (stationary phase) ：C 流动相 (flow phase)
4、 ：D 洗脱液 (elution) ：E 检测器 (detector) ：F 部分收集器 (portion collector) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 21 页色谱的分类：一，按应用的目的分类：A、 制备性色谱 (preparation Chromatography) ：工业规模，实验室规模B、 分析性色谱 (analytical Chromatography) ：GC、LC 、HPLC 、TLC等二，按流动相分类：A、GC: 气-固色谱法(固定相为固体) 气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为
5、固定相) B 、 LC 液-固色谱(固定相为固体) 液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上) 三，按色谱的展开形式：A、柱色谱法B、毛细管色谱法C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱四，按分离操作方式：A)、洗脱法B)、置换法C)、迎头法五，按原理分类：国际通用色谱法分类及缩写精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 21 页色谱的名词术语：分配系数m：式中， cs和 cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。意义：容易理解，溶质流过色谱柱时，m 大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m 小的组份需要的时间短；当样品中各组份在两相的m 不
6、同时，就能实现差速迁移，达到分离的目的。基线： 当没有样品进入检测器，在实验条件下，检测器输出不变的电压和电流信号。稳定的基线是一条平行于时间横坐标的直线，如图中的CD线。峰高： 以 h 表示， 组分从柱后洗出最大浓度时检测器输出的信号值，及色谱顶点向基线作垂msccm精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 21 页直的距离，图中AB 所示，色谱峰高一般用毫伏（mV) 、毫米（ mm)、或检测器输出的信号单位表示保留值：死时间 tm : 不被固定相吸附或溶解的组份，即非滞留组份（如空气或甲烷）从进样开始到色谱峰顶（即浓度极大）所
7、对应的时间因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近保留时间tr :溶质通过色谱柱所需要的时间，即从进样到柱后洗处组份浓度最大值的时间，以 tR 表示。tr意义 ：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。调整保留时间tr: 溶质通过色谱柱的保留时间包括她在色谱柱流动相和固定相所消耗的时间。组份在流动相消耗的时间基本相同，因而定义溶质固定相中滞留的时间（即从保留时间扣除死时间）称为该组份的调整保留时间，以tR 表示死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总
8、和，当后两项很小而可忽略不计时，VM可由tm与流动相体积流速F0(ml/min) 计算：保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如下：调整保留体积VR：某组份 VR扣除 VM后，称该组份的VR，即相对保留值2,1：某组份2 与组份 1 的调整保留值之比，即：由于 2,1 只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC 、 HPLC中，广泛使用的定性数据。注意：2,1 绝不是两个组份保留时间或保留体积之比分配比 k, 即容量因子：意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数k 与 m 的关系：区域
9、宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：A、标准差：0.607 倍峰高处峰宽的一半。即图EF的二分之一B、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与的关系为即图中 GH的 1/2 C、基线宽度Y：也叫色谱峰底宽，色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。它与的关系是，即图中 TJ长度色谱曲线反映出的重要信息：msimmissiVVmVcVck,精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 21 页A、根据色谱峰的个数，可以断样品中所含组份的最少数；B、根据色谱
10、峰的保留值(或位置 )，可以进行定性分析；C、根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析；D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度，评价色谱柱分离效能；E、色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相 )选择是否合适的依据。色谱理论两组份完全分离必须满足：A、两组份的分配系数必须有差异；B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。吸附平衡：色谱过程的热力学研究，它是发展高选择性柱的理论基础当吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量q*同溶液中溶质的平衡应与温度有关。当温度一定时，吸附量只和浓度有关，q* = f(c) - 吸附等温线。A)、 Henry ty
11、pe 亨利模型在一定温度下， 平衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c 之间的关系为线性函数：m 为分配系数。适应条件：在低浓度范围之内成立。当浓度较高时，上式无效。此外还有佛罗因得利希模型，兰格谬尔模型，BET模型等塔板理论：色谱过程的动力学研究，它是发展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础塔板理论-柱分离效能指标1、 色谱柱看成是由许多小塔板组成，流过每个塔板的两相瞬间达到平衡；2、 塔板数高度H,色谱柱长度L，理论塔板数的关系为：n=L/H; 3、 流动相不可以压缩；4、 全部样品在进样开始时都集中在第一块塔板上；5、 物质的分配系数不随其浓度变化6、 将载气看作成脉动（间歇）过程
12、；mcq*精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 21 页7、 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；n 称为理论塔板数(theoretical plate number) 。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H 的增大而减小。n 与半峰宽及峰底的关系式为: 式中 tr(或 Y1/2)应采取同一单位(时间或距离 )。上式示：在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明 n 越大， H 越小，柱效能越高。在实际工作中，按上式计算出来的n 和 H 值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用 tR计算时，没有扣除死时
13、间tM，所以，常用有效塔板数n有效表示柱效：有效塔板高为：例 1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。塔板理论的特点和不足 :(1) 当色谱柱长度一定时，塔板数n 越大 (塔板高度H 越小 )，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2) 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3) 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4) 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指
14、出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第八章常见的生化分离色谱技术精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 21 页凝胶过滤色谱：凝胶色谱是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各种组份的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色谱技术。凝胶色谱按流动相类型分为两类：流动相为有机溶剂时为凝胶渗透色谱；当流动相为水溶液时，为凝胶过滤色谱。凝胶色谱的原理：含有不同分子大小组份的样品进入凝胶色谱柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔内， 只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱；较小的分子则能进入凝胶的微孔
15、内， 不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透。这种在颗粒内部扩散的结果， 使小分子在柱内移动速度最慢，中等分子次之， 大分子移动速度最快，最先流出。样品根据分子大小的不同，按分子从大到小依次顺序从色谱柱内流出。凝胶介质像分子筛一样，将大小不同的分子进行分离，因而凝胶色谱又叫体积排阻色谱。凝胶色谱的参数排阻极限： 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。分级范围 :能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数。Se
16、phadex G50 的溶胀率为500土30。凝胶粒径： 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。床体积： 1g 干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为911cm3/g 干胶。空隙 (外水 )体积： 指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即 V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000 kD 的水溶性蓝色葡聚糖凝胶色谱的理论Vt=Vo+Vi+Vg= R2h 凝胶柱床总体积Vt是凝胶外水体积Vo,凝胶内水体积Vi和干凝胶颗粒体积Vg之和洗脱体积： Ve=Vo+Kd*Vi Kd为每个溶质分子在
17、流动相和固定相之间的一个特定的分配系数Kd=0，溶质的分子体积大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来； Kd=1，说明这种溶质的分子体积小，完全在凝胶颗粒内部扩散，在洗脱过程中将最后流出。当0Kd1，表示离子交换剂对B+的结合力大于A+； 【RB】【RA】若 K1，表示离子交换剂对B+的结合力小于A+； 【RB】【RA】分类 ：阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，每种都可分强弱两种洗脱： 如果采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱。因此， IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法 (P153)(li
18、near gradient elution) 、阶梯洗脱法 (stepwise elution) 。恒定洗脱法：洗脱体积大,溶质洗脱不尽线性梯度西洗脱法：优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。阶梯洗脱法：优点：无须特殊设备，操作简单；缺点： 流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。离子交换层析的操作：1、 装柱： 选择合适的离子交换剂，经过预处理后，用合适的PH 的缓冲液（ pbs）装柱，注精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 21 页
19、意不要让离子交换剂暴露空气2、 层析柱平衡： 用泵将至少2 倍柱体积的缓冲液过柱。这一步的作用是使得柱床体系的内外达到平衡与均一，以利于后续目的蛋白的结合，注意点：缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍；平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速；平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、 pH 值与缓冲液一致为准，其中pH 值最重要3、 样品进柱： 将目的样品试剂加到交换柱上，经过一段时间之后，蛋白质将通过离子交换的方式，与介质相互作用而挂柱。并开始记录某吸光度下吸收值的变化（蛋白质为：280nm） ,注意点 :为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高
20、，样品浓度不宜太高4、 冲平： 用缓冲液洗涤离子交换柱无穿透峰为止，并在吸收峰下降段取样5、 洗脱： 用含与交换剂亲和力更大的离子的缓冲液进行梯度洗脱，并收集洗脱峰处的样品6、 再生： 用大量水洗4 倍柱体积，等再生处理措施7、 保存： 用泵将 2 倍体积的20%乙醇过柱，介质回收用于蛋白质分离纯化的介质多保存于液体中，保存时需加入一些抑菌剂等，有些只要采用20%乙醇保存即可离子交换层析的蛋白质操作注意事项：1、 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH 值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定2、 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采
21、用弱阳或弱阴离子交换剂3、 适当调节缓冲溶液的pH 值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH 值靠近其等电点 （不是等电点）其他注意事项：注意各种厂家提供柱材料的pH 范围；注意流速范围 （压力范围） ，以免损坏胶颗粒。注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）。准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的pH 及离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，不要有沉淀产生及颗粒物质;样品中应该避免含有去污剂及离液剂样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般无特殊的限制。在位清洗在位清洗（除去柱床的沉淀蛋白和顽固蛋白）除脂类，疏水蛋白的方法：使用递增式梯度以 4 10CV70%乙醇或 30%异丙醇
22、洗柱， 再用至少3CV蒸馏水过柱； 或以 0.5%非离子性去污剂（溶于1mol/L 乙酸中）洗柱，再用5CV70% 乙醇过柱，最后用4 10CV蒸馏水加以清洗。在位消毒在位消毒（将微生物感染降到最低）方法： 用 0.51mol/L 氢氧化钠以该凝胶的建议流速洗柱，约 0.51h 然后以最少3CV平衡缓冲液过柱离子交换层析特点：优点： 处理量大，浓缩，高速；选择高，所需柱长较短；回收率高；离子交换剂种类多，价格也远低于亲和吸附剂缺点 ：IEC的操作变量远多于GFC ，影响分离特性的因素非常复杂精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，
23、共 21 页疏水色谱（疏水性相互作用层析）疏水性相互作用层析的原理疏水性相互作用层析(Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团 (疏水性配基 )的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大。 尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。
24、这部分疏水基团可与固定相表面弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相 (疏水性吸附剂 )所吸附。疏水层析的操作柱子和填料准备样品制备样品上样洗脱洗涤和在平衡分析结果吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH 和离子强度，也要考虑温度因素。为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的洗脱剂每次实验结束后，吸附剂需要再生。因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸
25、附容量将明显降低。一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。疏水性相互作用层析的应用及特点1st互补工具： HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如 IEC的应用广泛，但可以作为 IEC的互补工具。如方法得当，HIC与 IEC的分离效率相当。2nd 与盐析衔接： 由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此 HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可
26、根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th 疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。反相层析反相层析定义和原理：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 21 页(Reversedphase chromatography ，RPC) 是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性 )的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与前述 HIC 同样， RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂
27、（如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是 1000 以下的非极性小分子物质的分析和纯化， 也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。与其它层析法一样，当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性(水含量 )的线性梯度洗脱法。
28、反相介质反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面缝合非极性分子层制备。除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSK gel Octodecyl4PW 和 TSK gel Octadecyl NPR(聚丙烯酸酯 C18)等。反相层析的特点反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。因此，RPC做为定量分析手段，广泛应用于科学研究、 临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。做为产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规模工业生产中应
29、用较少。反相色谱与疏水色谱的不同在哪几方面：1、 疏水配机的密度不同2、 流动相体系不同，PRC流动相一般为有机溶剂（如甲醇、乙醇） ，而 HIC流动相则为水溶液3、 再生条件不同。PRC再生在剧烈条件下，如采用极性小的有机溶剂，使得蛋白质溶液易变性，因此RPC主要用于小分子肽或蛋白质，而疏水色谱主要针对大分子，采用降低盐浓度等方法进行再生，条件比较温和。疏水色谱主要用于分离含有疏水基团较多的蛋白质亲和层析：生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
30、称为亲和分离技术亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 21 页亲和层析原理亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙-锁关系亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用亲和作用中的相互作用力：静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键影响亲和作用的因素：离子强度pH 抑制氢键形成的物质温度螯合剂亲和层析的操作及影响因素过程：进料清
31、洗洗脱柱子再生。应保证配基对目标产物有较高的吸附容量。目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用Freundlich 或 Langmuir 型的等温式表示。进料过程中的杂质影响料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。进料的料液流速流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。目标产物洗脱特异性洗脱精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 21 页洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物非特异性洗脱：调节洗脱液的pH
32、 值，离子强度，离子种类或温度等理化性质。常见亲和色谱：免疫亲和色谱：利用抗体 作为配基的亲和色谱。色素亲和色谱：利用色素 作为配基的亲和色谱。t-PA的纯化 -酶的抑制剂为配基固定化金属离子亲和层析相关概念和参数：配基（ ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。亲和层析配体类型：酶的抑制剂 : 大豆胰蛋白酶抑制剂抗体：抗体 -抗原， Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析A 蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶
33、，激酶结合。过渡金属离子 :Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸 : 咪唑环，静电和疏水作用。肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。特异性亲和体系高特异性酶-底物、产物、抑制剂抗原 -单克隆抗体荷尔蒙 -受体蛋白核酸 -互补碱基链段群特异性免疫球蛋白 -A 蛋白、 G 蛋白酶-辅酶酶、蛋白质 -过渡金属离子（Cu2+,Zn2+) 凝集素 -糖、糖蛋白、细胞表面受体间隔臂的作用：当配基分子量较小时， 为了排除空间位阻作用， 需要在配基和载体之间连接一个 “ 间隔臂 ” 间隔臂的长度有一定限制， 超过一定长度后， 配基与目标分子的亲和力会减弱层析的操作（一）凝胶的
34、选择与处理精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 21 页1.凝胶及柱的选择根据样品的分子量选择合适的凝胶及层析柱。2.凝胶的处理凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10 倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2 小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。（二）装柱1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3 柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边
35、将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降， 等凝胶沉降约2-3cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm 处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡通过 2-3 倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。（四）加样1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液 1 mL 小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液
36、流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用 1 mL 洗脱液冲洗管壁2 次。最后加入34 mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶， 柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。（五）洗脱洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LTris-HCl，以每管3 mL/10 min 流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。（六）收集各洗脱峰注意事项：1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表
37、面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。主要色谱的比较：（P122）精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 21 页下游操作的三个阶段：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 21 页亲和分离技术亲和分配利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在配基的亲和作用下促进目标产物在PEG相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。这就是亲和萃取，又称亲和分配 . 亲和萃取 -原理亲和萃取分离， 是
38、利用生物大分子和天然产物分子在两水相中不同的分配系数进行分离的纯化技术， 由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对蛋白无毒性、分离设备与化学工业通用，易于处理成吨物料等优点，在大规模工业生产上目益受到重视。亲和萃取 -操作亲和萃取是在水中加入两种高聚物，或一种高聚物和一种无机盐经混合所形成的两相体系，利用生物大分子或天然产物分子在两相中分配系数不同的原理，通过控制聚合物分子大小、成相浓度、 PH 值、无机盐种类等条件控制目标分子在两相中的含量，来达到快速、大规模分离纯化目标物质的目的。亲和萃取回收效率高，易于进行连续化操作，且设备简单，与普通化工设备通用。双水相萃取具有的这些性质使它适合于萃取生
39、物分子或用于酶催化反应。印迹技术（ blotting ）是指将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程。分子印技术原理和操作：一种新的、很有发展潜力的分离技术。利用分子印迹技术，能够制备具有特异识别功能的色谱介质。分子印记聚合物(MIP)是通过模板分子、功能单体和交联剂的作用产生有化学选择性的键合位点的一种技术。待测底物通过与模板分子聚合物在形状、大小和功能基团的定位方面吻合而被识别。(1) 功能单体印迹分子结合(2) 交联剂固定(3) 脱去印迹分子分子印技术分类共价键法（预组装法）和非共价键法（自组装法）分子印技术的应用色谱技术固相萃取膜分离传感器敏感材料高效毛细管电泳(HPCE) 精
40、选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 21 页亲和沉淀 (Affinity precipitation) 生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术。实质：亲和沉淀实质是配体-产品复合物的沉淀。在亲和沉淀的研究中，现在主要是采用亲和配体-溶解可逆聚合物作为蛋白质的亲和沉淀剂。亲和沉淀被认为是分离纯化酶及蛋白质的强有力的技术手段，这种方法可以较经济有效地使用配基，能够大规模、快速、 特异性地分离纯化酶及蛋白质。第十一章：电泳技术 , 定义：是荷电溶质 （电解质） 在电场作用下发生定向泳动的现象，称为电泳（
41、Electrophoresis ）简称 EP 。电泳技术：是根据荷电溶质在电场中泳动速度的差别对物质进行分离的一种实验方法电泳的基本原理：1、带电颗粒溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附带电荷而带电，在电场中就会发生迁移2、电泳迁移率电泳迁移率（mobility ）:即单位电场强度下的迁移速度,电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础；电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒电荷有关。在确定条件下，物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。3、泳动速度在一定的条件下， 任何物质都有自己特定的泳动速度，泳动速度是胶体颗粒的一个物理常数；由此可以看出， 电泳速度随电位梯度E或溶液的导电
42、性K变化而改变。 电场强度越高， 电泳速度越快，溶液的导电性越强，电泳速度越慢影响电泳的基本因素：1、颗粒的性质： 颗粒带的静电荷越多，直径越小，而且形状越接近球形，其泳动速度越快；2、电场强度E ： 电场强度越大，泳动速度越快3、溶液性质：主要指的是电解质和蛋白质样品溶液的pH 值、离子强度和溶液粘度?介质的 pH 值： 决定了蛋白质的解离度及其所带的静电荷量，溶液的pH 远离其 pI 的蛋白质的泳动速度越快?介质的离子强度：离子强度一般在0.02-0.2 之间时，电泳比较合适。?溶液粘度： 与泳动速度成反比4、 电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会存在一些离子基团如羧基、羟基、磺酸基、
43、 硅醇基等，这些基团会吸附溶液中的正离子而使得靠近支持物的溶液层相对带电，那么溶液层在电场作用下会向负极移动（A） ，反之，往正极移动(B)。这种溶液层的泳动现象称为电渗（electroosmosis） ,电泳层受到的力称为电渗力。因此， 当颗粒的泳动方向跟电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动，反之则降低颗粒的泳动速度。 当颗粒的泳动力等于或小于电渗力时，颗粒不泳动或甚至出现朝相反方向泳动的现象5、 焦耳热精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共 21 页电泳过程中释放的热量（Q）跟电流强度（I )的平方成正比；当电场中样品或电极缓
44、冲液的离子强度增大时，电流强度会随之增大，这不仅会降低分辨率，影响泳动速度，而且严重时会使支持物介质变形甚至融化6、 支持物（筛孔）支持物如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的孔径，在筛孔大的支持介质中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。电泳的分类：自由界面电泳： 溶质颗粒经过电泳后，在胶体颗粒和缓冲溶液之间形成界面，带电颗粒的泳动速度通过光学方法观察界面的移动来测定。区带电泳： 样品在一惰性物质上进行电泳的的过程。因电泳后样品中不同的成分可形成独立的带状区间而命名。区带电泳又分两类：一类仅起支持和抗扩散、抗对流作用，另一类不仅起以上作用，还可以起到分子筛功效。如琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶等。
45、区带电泳分辨率好，操作简便，被广泛用于物质分离和生化分析凝胶电泳：定义：凝胶电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢， 小分子溶质泳动速度较快。经过一段时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。凝胶电泳支持的介质：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG ）琼脂糖凝胶；聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE ） ：是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。聚合的主要因素引发剂和增速剂的浓
46、度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060 分钟内完成。系统 pH 值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH 值，以获得最佳的聚合结果；温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合琼脂糖凝胶电泳：支持物琼脂糖是从琼脂中精制分离出的胶状多糖，常用于测定核酸的分离及大小检测琼脂糖凝胶的性能、结构与特点其特点如下：?琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，用于分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳
47、低。?生物中性：一般不与生物材料结合；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 21 页?无毒；?机械强度高：可以在浓度1%以下使用；?电内渗（ EEO ）大：对于对流电泳有益；?染色、脱色程序简单，背景色较低；?样品易洗脱，便于定量分析；?热可逆性，凝胶可以回收。?还可选择改进的低熔点的琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶体系，可避免洗脱样品时双链DNA解构；琼脂糖凝胶电泳电泳过程：凝胶的制备 DNA 样品准备和加样设置电压，开始电泳常规聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理?在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，
48、因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。?凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状?凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity） ，这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect ）电泳分子筛效应与柱层析分子筛效应有何区别？分子的迁移速度有差别变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE ?在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基磺酸钠（SDS ）或尿素， 用其作为支持物进行的凝胶电泳称为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；?主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；?特点：设备简单、操作简便、测定快速、重
49、复性高、样品无需纯化。原理蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、 -巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后， 蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合，形成蛋白质-SDS胶束；SDS带大量负电荷， 其所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异，所有蛋白质都呈负电；同时，蛋白质-SDS 聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。电泳应用：分离、纯化、分析、分
50、子量的测定第十二章基因重组蛋白包涵体的分离和复性蛋白质结晶技术：悬滴发： 适用于微量的筛选结晶条件，可根据实验结果筛选出一种沉淀剂浓度作为最佳结晶精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 20 页，共 21 页条件坐滴法： 这种方法蛋白质用量较大，较易生长出大的晶体，重复性较好。平衡透析： 该法既适用于大批量的结晶，亦可应用于微量结晶。蛋白质结晶要点：要点：蛋白质结晶时必须保持在高浓度水合状态。结晶通常是室温下进行。?pH 是重要因素。结晶溶液一般选择在被结晶蛋白质的等电点附近，调整pH 可使结晶长到最佳大小，也可改变晶形。?要使生物大分子结