《2022年猪血中超氧化物歧化酶的分离纯化及活力测定、同工酶电泳 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年猪血中超氧化物歧化酶的分离纯化及活力测定、同工酶电泳 .pdf（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、个人收集整理仅供参考学习1 / 8 一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase， SOD） 是一种能专一地清除超氧离子自由基（）的金属酶， 它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。个人收集整理勿做商业用途SOD 是一种酸性蛋白，对热、pH 和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD （二聚体，蓝绿色） 、Mn-SOD （紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。个人收集整理勿做商业用途SOD 催化下述反应： 2+2+。 机体内的过量和不足均对机体不利，SOD对
2、过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。机体内的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。过量的如不及时清除，会对细胞损伤。SOD 将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。个人收集整理勿做商业用途2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD 并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理：亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形
3、成沉淀； 水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。个人收集整理勿做商业用途3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD 酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定， 酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1 个酶单位。 邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色
4、，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在34 min 内维持线性关系。 加入酶液则抑制自氧化的速率，在 325 nm 波长处测定吸光度值即可。个人收集整理勿做商业用途4.蛋白质含量测定样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250 法测定。考马斯亮蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250） 在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内， 溶液在 595 nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在11 000 g。个人收集精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 8 页个
5、人收集整理仅供参考学习2 / 8 整理 勿做商业用途5.SOD 同工酶分离鉴定SOD 同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“ 负” 显色法，核黄素（ FAD）经光照所产生的（氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT ）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD 能够抑制的作用，因此，电泳分离SOD 后，凝胶上无SOD 出应显示为蓝色，而有SOD 处则无色透明，由此可鉴定SOD 同工酶的酶谱（即同工酶的种类数量、分子量大小分布及活性大小）。个人收集整理勿做商业用途二、操作步骤1.SOD 的提取1取新鲜猪血20ml 于 50ml 离心管， 6000r/min ，10min 离心，去
6、上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2 倍体积的0.9%NaCl 溶液清洗， 6000r/min，10min 离心，弃上层清液，再加入2 倍体积的0.9%NaCl 溶液重复清洗一次，6000r/min ，10min 离心，得洗净的红血球粘稠液。个人收集整理勿做商业用途2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。 再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25 倍体积的95%乙醇溶液和0.15 倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min ，10min 离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（ 样1） 。 然后将清液在65-70恒温水浴中进行热
7、处理，15min 后取出迅速冷却到室温，4000r/min ，5min 离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样 2） 。个人收集整理勿做商业用途3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，6000r/min ，10min 弃上清液，得沉淀。 将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀， 自然干燥即得淡绿色成品，溶于3 ml 蒸馏水，备用（样 3） 。个人收集整理勿做商业用途2.SOD 活力测定1 邻苯三酚自氧化率的测定取 4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液， 4.2 ml 蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保
8、温20 min ，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml ，迅速摇匀，倒入光径1 cm 的比色杯内，用10 mmol/L HCl 作空白， 325 nm 波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min 内完成， 计算出每分钟A325的增值， 此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min 左右。个人收集整理勿做商业用途2 酶活力测定样 1、样 2 及样 3 中 SOD 酶活力测定操作与1基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD 样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。个人收集整理勿做商业用途3 酶
9、活性单位计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习3 / 8 单位活性（ U/ml ）= 反应液总体积数其中，为邻苯三酚自氧化率；加酶后邻苯三酚自氧化率。总活性 (U)单位活性 酶原液总体积4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250 法） ： 标准曲线的制作：取6 支具塞试管，编号，按下表加入试剂：试剂试管编号1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ ml ）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
10、 考马斯亮蓝G-250（ml）5 5 5 5 5 蛋白质含量（g）0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10 分钟，在595nm 波长下比色测定光吸收值，比色应在1 小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。个人收集整理勿做商业用途 样品中蛋白含量的测定将待测的 SOD 溶解并稀释到一定浓度，取3 支试管，分别加入50 l、100 l、 100 l 的样 1、样 2 和样 3，再分别加入950 l、900 l 和 900 gl 蒸馏水， 3 支试管中都加入5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，其余操作与标准曲线制
11、作相同。个人收集整理勿做商业用途 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量( g)，计算其浓度。5 结果处理利用考马斯亮蓝G-250 法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。比活力（ U/mg ）=将测得的数据或计算结果填入下表：提纯步骤酶液总体积 ml 蛋白质mg/ml 酶活性U/ml 总活性U 比活性U/mg 回收率(%) 纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的3.SOD 同工酶鉴定（聚丙烯酰胺凝胶法）1 样品制备取一定浓度 （约 SOD 0.5mg/ml ） 酶液，酶液与 40%蔗糖按 1： 1 的体积比例配成样品液，备用。2 制备凝胶(1)用蒸馏水清洗
12、两块玻璃板，两条玻璃间隔条和一把梳子，凉干备用。(2)组装玻璃板。平放大玻璃板，盖上有凹槽的小玻璃，用4个蝴蝶夹左右两边夹住玻璃的两条边固定这个组装系统，左右两边封到34 cm高即可。个人收集整理勿做商业用途精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习4 / 8 (3)配胶。取两只洁净的小烧杯、标号，按下述试剂配方：试剂分离胶浓缩胶30%Acr-Bis （ml）2.0 0.4 Tris-HCL PH8.9 缓冲液（ ml）1.5 Tris-HCL PH6.7 缓冲液（ ml）0.5 H2O（ml）4.5
13、 1.5 10%AP（ ml）0.15 0.075 (4)灌胶。混合好胶液，应马上进行灌胶。左手扶住组装好的玻璃板，45度倾斜，凹形的小玻璃板朝上，右手将烧杯中胶液从凹口夹逢中均速灌入，待满至离玻板口4cm左右停止灌分离胶。 加蒸馏水水压线，当界面开始出现明显的分隔线的时候，将水倾倒出，用滤纸吸干水分（注意不要损坏胶面）。将配好的浓缩胶按照同样的方法匀速均匀倒入，满至从顶部溢出，水平插入梳子，梳子的深度约1 cm为好，过深，取梳子时容易损坏胶孔；过浅，上样量受限制。 注意：灌胶和插梳子时应避免产生气泡。气泡将严重影响凝胶的质量，继而影响实验结果。个人收集整理勿做商业用途(5)静置凝胶 30 m
14、in完成聚合反应。(6)清理玻璃凝胶板。 小心取出梳子， 去掉透明胶和 4个蝴蝶夹， 清洗玻璃板周边的碎胶，最后蒸馏水冲洗一遍后吸水纸擦干。此步操作应避免挤压玻璃板使胶变形。个人收集整理勿做商业用途3 上样(1)把清理好的玻璃凝胶板插入双垂直电泳槽，大玻璃面朝外，凹形的小玻璃朝里，分别用 4个蝴蝶夹将玻璃凝胶板固定在电泳槽上。第二张胶板的装法与第一张一致。如电泳槽只跑一张胶，则只需把大玻璃固定在另一边，形成装缓冲溶液的上槽即可。个人收集整理勿做商业用途(2)在电泳槽的上、下槽中加入电泳缓冲液，上槽的缓冲液加至淹没凝胶15cm，下槽加至没过底边玻璃15cm ，观察上槽是否漏液，如果漏液，必须重新
15、组装。个人收集整理勿做商业用途4 电泳当指示剂溴酚兰离下边缘还有1cm的时候停止电泳，下胶染色。5 取出胶板显带用硬质卡片揭去一块玻璃板，另一块板上的凝胶面倾斜，沿着凝胶一角注水，将胶版冲入培养皿，充分展开。倒入NBT 溶液，严格避光浸泡20min，再放在 2.8ml/L 的EDTA-Na2 溶液中， 放置在日光下照射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，观察结果，拍照绘制模式图。个人收集整理勿做商业用途三、结果1.SOD 活力测定将含有 SOD 的样 1、样 2 及样 3 加入邻苯三酚自氧化过程的反应液中，记录加样体积及每 30 s 观察的吸光度值，与邻苯三酚自氧化率测定过程吸光度值同记录与下
16、表：个人收集整理 勿做商业用途计时吸光度值A325邻苯三酚自氧化加 SOD 后的邻苯三酚自氧化样 1a样 2b样 3c精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习5 / 8 00:00:00 0.012 0.024 -0.039 0.034 00:00:30 0.045 0.031 -0.034 0.051 00:01:00 0.083 0.040 -0.028 0.068 00:01:30 0.124 0.050 -0.022 0.085 00:02:00 0.163 0.058 -0.017 0.1
17、01 00:02:30 0.201 0.067 -0.012 0.116 00:03:00 0.237 0.076 -0.007 0.132 00:03:30 0.270 0.084 -0.001 0.147 00:04:00 0.302 0.093 0.000 0.161 a样 1 为除去变性蛋白沉淀物后的上清液，加样体积为50 l；b样 2 为热处理后除去沉淀物得到的上清酶液，加样体积为100 l；c样 3 为加丙酮后沉淀物溶于蒸馏水而得的溶液，加样体积为100 l。根据公式：单位活性（ U/ml ）= 反应液总体积数邻苯三酚自氧化率A0=（0.302-0.012）/4 min=0.072
18、50min-1加入样 1、样 2和样 3 后邻苯三酚自氧化率Am分别为：A1=（0.093-0.024）/4 min=0.01725min-1A2=（0.000+0.039）/4 min=0.00975min-1A3=（0.161-0.034）/4 min=0.03175min-1反应液总体积都为10 ml，即反应液总体积数均为10；样 1、样 2 和样 3 均未稀释，即样液稀释倍数都为1。因此，样1、样 2 和样 3 中 SOD 单位活性分别为：个人收集整理勿做商业用途b1= 10=304.873U/ml个人收集整理勿做商业用途b2= 10=173.103U/ml个人收集整理勿做商业用途b3
19、= 10=112.414U/ml个人收集整理勿做商业用途样 1、样 2 和样 3 的酶液总体积分别为V1=10.0 ml 、 V2=9.5 ml 和 V3=8.5 ml ，故其酶总活性分别为：个人收集整理勿做商业用途c1=b1V1=304.873 U/ml 10.0 ml=3048.276 U c2=b2V2=173.103 U/ml 9.5 ml=1644.483 U 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习6 / 8 c3=b3V3=112.414U/ml 8.5 ml=955.517 U 以除
20、去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）中活性SOD 的回收率为k1=100%，按酶总活性的大小计算各过程中SOD 的回收率，则样2 和样 3 的回收率分别为：个人收集整理勿做商业用途k2=c2/c1=1644.483 U/3048.276 U=53.95% k3=c3/c1=955.517 U/3048.276 U=31.35% 2.蛋白质含量测定蛋白质含量与吸光度值A595的标准曲线测定值如下表：蛋白质含量（g）0 20 40 60 80 100 吸光度值 A5950.000 0.294 0.314 0.402 0.54 0.672 去掉偏差较大的点（0.294， 20 g）后标准曲线拟合如下
21、图：样 1、样 2 和样 3 的加样量及吸光度值记录于下表：样品号加样量 / l 吸光度值A595重复重复样 1 25 0.304 0.341 样 2 100 0.150 0.145 样 3 100 0.048 0.054 因此，样 1、样 2 和样 3 中蛋白质含量分别为：d1=1.8903 mg/ml d2=0.2162 d3=0.0748所以，样 1、样 2 和样 3 的比活力分别为：e1= b1/d1=161.2048 U/mg e2= b2/d2=800.6213 U/mg A595蛋白质含量/g精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - -
22、-第 6 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习7 / 8 e3= b3/d3=1503.7058 U/mg 以除去变性蛋白沉淀物后的上清液（即样1）得到的SOD 纯化倍数为n1=1，以各样的比活力计算纯化倍数，样2 和样 3 的纯化倍数分别为：个人收集整理勿做商业用途n2=e2/e1=800.6213 Umg-1/161.2048 Umg-1=4.96 n3=e3/e1=1503.7058 Umg-1/161.2048 Umg-1=9.32 酶活力测定的结果汇总于下表：提纯步骤酶液总体积 ml 蛋白质mg/ml 酶活性U/ml 总活性U 比活性U/mg 回收率(%) 纯化倍数除血蛋白上清10
23、 1.8903 304.873 3048.276 161.2048 100 1 热变性后上清9.5 0.2162 173.103 1644.483 800.6213 53.95 4.96 丙酮沉淀后的8.5 0.0748 112.414 955.517 1503.706 31.35 9.32 3.SOD 同工酶鉴定同工酶电泳凝胶中出现两条透明酶带，模式图绘制如下：两条透明的酶带说明猪血中含有SOD 同工酶，同工酶将核黄素经光照后产生的活性氧（氧自由基）清除，使得凝胶呈无色透明。个人收集整理勿做商业用途四、分析超氧化物歧化酶 （SOD）广泛存在于真核细胞核和原核细胞的细胞质、线粒体和叶绿体中，可
24、清除生物体内超氧阴离子自由基，有效抵抗氧自由基对机体的伤害1。通过对SOD的提取、分离和纯化，发现猪血中含有丰富的SOD，且 SOD 的活性较高。此外，通过对提取样液的聚丙烯酰胺凝胶，可以看出猪血中还含有SOD 的同工酶。个人收集整理勿做商业用途本实验中分离纯化的SOD 在丙酮沉淀后的比活力为1503.7058 U/mg ，与李敏康2等研究显示的猪血SOD 比活力较为一致。但前人对猪血中SOD 活力研究表明，在60下处理15 min，SOD 活力最大，比活力可达4 000 U/mg 以上3-4，更有研究表明猪血中SOD 比活1 8 9 10 7 6 5 4 3 2 精选学习资料 - - - -
25、 - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 8 页个人收集整理仅供参考学习8 / 8 力可以达到6 000U/mg 以上5-6，影响猪血中SOD 活性的因素很多，从猪血中提取SOD 的过程中，若要分离出纯度很高的SOD，热变性时的温度是至关重要的因素3,7-8。实验结果显示猪血中SOD 回收率仅为31.35%，纯化倍数仅有9.32。而前人在丙酮沉淀后SOD 的回收率可以达到近60%甚至更高4,6，晏本菊4等从猪血中制备SOD 时纯化倍数达26.00。个人收集整理勿做商业用途SOD 同工酶电泳结果表明，猪血中含有SOD 的同工酶，且活性较高，但是种类数量很少。对
26、于 SOD 的同工酶， 在水生生物 （鱼类等） 和植物中研究较多9-12，而关于猪血中SOD同工酶鲜见报道。对其他动物和植物的研究显示，SOD 的同工酶种类较多，分子量分布也较为广泛9-12。个人收集整理勿做商业用途本实验中提取的猪血中的SOD 的比活力相对较低，回收率和纯化倍数也非常低，鉴定出的 SOD 同工酶数量极少，可能的原因有供试用猪血新鲜程度不够，导致其中 SOD 已有部分失活， 而提取设备和条件的不足也是导致实验结果不够理想的重要原因，此外， 操作人员对提取过程的熟练程度也是影响结果的因素之一。个人收集整理勿做商业用途参考文献1 陈鸿鹏 ,谭晓凤 .超氧化物歧化酶（SOD）研究综述
27、 J.经济林研究 ,2007,25(1):59 65.个人收集整理勿做商业用途2 李敏康 ,钱冬明 ,宋宏新 .猪血SOD 提取条件的研究J.陕西科技大学学报,2007,25(3):5052.个人收集整理勿做商业用途3 周存六 ,程元珍 ,方红美 ,等.猪血中SOD 的制备工艺及其应用研究J. 肉类工业,2010, (1):3335,39.个人收集整理勿做商业用途4 晏本菊 ,苟琳 ,杨婉身 ,等 .猪血生产SOD 及复合氨基酸研究初报J.四川农业大学学报,1994,12(1):133 136.个人收集整理勿做商业用途5 邱玉华 ,杨艳芳 ,何颖 ,等 .等电点沉淀超滤提取猪血SODJ. 科技
28、资讯 ,2008,(14):223.个人收集整理勿做商业用途6 徐亚欧 .猪血超氧化物歧化酶（SOD）性质的研究J.畜禽业 ,2003,(9):4849. 7 张小东 ,宋伟 ,张根军 ,等.温热环境对生长猪血清SOD 和 CK活性影响 J.山东畜牧兽医,2004,(4):3 5.个人收集整理勿做商业用途8 顾洪雁 ,袁均林 ,王建和 ,等.温度对猪血提取超氧化物歧化酶的影响J.华中师范大学学报,2002,36(3):358 360.个人收集整理勿做商业用途9 崔雪 ,张引 ,黄孝湘 ,等 .克氏元鳌虾SOD 同工酶的组织特异性研究J.河北农业科学,2008,12(11):55 56,84.个
29、人收集整理勿做商业用途10 张丽燕 .对狗鱼不同组织同工酶的研究J.北京水产 ,2008,(2):9 13,19. 11 杜震宇 ,邵邻相 .5 种动物 LDH 和 SOD 同工酶的比较研究J.华南师范大学学报（自然科学版） ,2002,(1):117122.个人收集整理勿做商业用途12 程光宇 ,王峰 ,陶明煊 ,等.聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和均一凝胶电泳分离及鉴定植物SOD同工酶中的比较研究J.南京师大学报（自然科学报）,2008,31(4):97 103.个人收集整理勿做商业用途精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 8 页