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1、山东省医疗器械产品质量检验中心医疗器械生物学评价相关规章n国家食品药品监督管理总局2014年第43号n关于公布医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心 依据GB/T16886/ISO10993系列标准基本原则制定了两项医疗器械生物学试验方法的国家标准：nGB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法nGB/T16175-2010医用有机
2、硅材料生物学评价试验方法山东省医疗器械产品质量检验中心1. 1.基本评价试验基本评价试验n细胞毒性细胞毒性-GB/T16886.5-GB/T16886.5n刺激或皮内反应（皮肤、刺激或皮内反应（皮肤、 皮内、眼、口腔、阴道、直肠、皮内、眼、口腔、阴道、直肠、阴茎）阴茎）-GB/T16886.10-GB/T16886.10n致敏致敏-GB/T16886.10-GB/T16886.10n血液相容性（血栓、凝血、血小板、溶血、补体、血液学）血液相容性（血栓、凝血、血小板、溶血、补体、血液学）-GB/T16886.4-GB/T16886.4n植入试验（皮下、肌肉、骨）植入试验（皮下、肌肉、骨）-GB/
3、T16886.6 -GB/T16886.6 n全身毒性（急性全身毒性、重复接触全身毒性）全身毒性（急性全身毒性、重复接触全身毒性）-GB/T16886.11GB/T16886.11n遗传毒性遗传毒性(AEMS(AEMS、染色体畸变试验、小鼠淋巴瘤）、染色体畸变试验、小鼠淋巴瘤）-GB/T16886.3GB/T16886.3山东省医疗器械产品质量检验中心2. 2.补充评价试验补充评价试验 （1 1）慢性毒性）慢性毒性口、吸入、经皮、静脉、腹口、吸入、经皮、静脉、腹膜、植入途径。膜、植入途径。 （2 2）致癌性。）致癌性。 （3 3）生殖和发育毒性。）生殖和发育毒性。 （4 4）生物降解）生物降解
4、聚合物、金属、合金、陶瓷。聚合物、金属、合金、陶瓷。山东省医疗器械产品质量检验中心医疗器械生物学试验样品制备n参考标准：GB/T16886.12-2005（ISO10993-12:2002)n试验样品的选择和制备标准化是保证生物学评价试验结果可靠性和可比性的很关键的一步。n在进行试验以及解释试验结果时，应考虑器械在人体应用时的接触性质、程度、频率、时间和条件等因素，其中最关键的因素之一就是试验样品的制备。n当制备器械浸提液时，所用的浸提介质和浸提条件应该既与最终产品的性质和用途相适应，又要与试验方法的可预见性（如试验目的、原理、敏感性等）相适应。因此理想的浸提条件和试验系统浸提液的应用既要反映
5、产品的实际使用条件，还要反映试验的目的和预测性。山东省医疗器械产品质量检验中心医疗器械生物学试验样品的选择n1. 应采用最终产品、最终产品中有代表性的样品或与最终产品相同的最终产品、最终产品中有代表性的样品或与最终产品相同的工艺过程制得的材料工艺过程制得的材料以及它们的浸提液进行试验。选择的样品必须被证明合理。n2. 处置试验样品与参照样品时应谨防污染。来自制造过程的任何残留物应视为器械、器械部件或组件的构成部分。n（1） 试验样品如取自非无菌状态，但要求使用前灭菌的器械，试验样品应按照制造厂家推荐的灭菌方法灭菌厂家推荐的灭菌方法灭菌，必要时，试验应采取无菌操作。n（2）如果试验样品在灭菌前清
6、洗，应考虑清洗过程和清洗剂对试验样品选择和处置方面的影响。n3如果试验过程要求无菌试验样品，应考虑灭菌或再灭菌过程对试验样品和参照材料的影响。n4当试验样品和参照材料需要分割成小片时，应考虑原先没有暴露的表面（如腔或切面）的影响。山东省医疗器械产品质量检验中心医疗器械生物学试验样品的选择n6. 从器械选择有代表性的部分n（1）如器械不能以整体用于试验时，应选取最终产品中各种材料有代表性的部分按比例组合成试验样品。n（2）有表面涂层器械的试验样品应包括涂层材料和基质材料，即使基质材料没有和组织接触。n（3）与病人接触的器械部件在制造过程中如使用了粘结剂、射频密封或溶剂密封，试验样品则应包括粘接和
7、/或密封处有代表性的部分。n（4）复合材料应作为最终材料进行试验。n（5）当一个器械由不同的材料组成，在选择试验样品时，应考虑其潜在的协同作用和相互作用。n（6）选择的试验样品应能使器械组件最大限度地与试验系统接触，以了解潜在的生物学。山东省医疗器械产品质量检验中心浸提条件和方法n浸提温度n浸提时间n浸提比例n浸提介质山东省医疗器械产品质量检验中心浸提温度和浸提时间n可采用下列的一个条件进行浸提：n(371)，（722）h；n(502)，（722）h；n(702)，（242）h；n(1212)，（10.1）h；山东省医疗器械产品质量检验中心注：n在多数情况下为产品使用适宜的加严条件。n对于细胞
8、毒性试验，含血清的细胞培养介质可在(371)，（242）h条件下浸提。n采用高温浸提时应注意：n可能会导致聚合物的交联和/或聚合作用增强； 可能会引起材料明显出现降解。n可降解材料浸提时要用适当的介质、时间、温度条件来模拟尽可能的过度暴露。完全的溶解是适当的。山东省医疗器械产品质量检验中心标准表面积和浸提液体积山东省医疗器械产品质量检验中心注：n标准的表面积包括样品两面和连接处的面积，不包括不确定表面的不规则面积。当由于样品外形不能确定其表面积时，浸提时可使用质量/体积。n浸提之前应将材料切成小块，以使材料浸没在浸提介质中。 n由于完整表面与切割表面存在潜在的浸提差异，因此对于弹性体、涂层材料
9、、复合材料、层状薄片等应尽量采用完整的样品进行试验。山东省医疗器械产品质量检验中心浸提介质n浸提介质示例：n极性介质：水、生理盐水、无血清培养皿；n非极性介质：各国药典中规定的新鲜精制植物油（如棉籽油或芝麻油）；n其余介质：乙醇/水、乙醇/生理盐水、聚乙二醇400（稀释至生理渗透压）、二甲基亚砜和含血清培养基。山东省医疗器械产品质量检验中心浸提液制备的注意事项n浸提应在搅拌的条件下进行。当认为静态适宜时，应对试验方法加以论证、规定并出具报告。n如可能, 液体浸提液应在制备后立即使用, 以防止吸附在浸提容器上或成分发生其他变化。n不应调整浸提液的ph值除非给出理由。n浸提液一般不应采用过滤、离心
10、或其他方法来去除悬浮的粒子，如果必须进行时，应说明其理由。山东省医疗器械产品质量检验中心浸提液制备的注意事项n对于在使用条件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，进行浸提的任何溶剂不应导致聚合物发生分解。聚合材料在挥发性溶剂中只应发生轻微变软（如小于10%的溶解度）。n如果器械是不能浸提的水状液体，可用液体直接进行试验。n在正规使用条件下液体是在器械内循环，可以采用循环方式进行浸提，尽可能加大一个或多个实验条件，如温度、时间、体积、流速。选择这种浸提方式的基本原理应该在报告中注明。山东省医疗器械产品质量检验中心n细胞毒性试验山东省医疗器械产品质量检验中心细胞毒性试验n现有版本是GB/T16886.
11、5-2005（ISO10993-1999），GB/T16886.5-20 xx（ISO10993-2009）正在报批中。n敏感性高、重现性好，结果有一定的临床相关性，因此被广泛地应用于医疗器械生物学评价中，特别是作为新材料筛选时的必做试验。国内外无论哪项医疗器械生物学评价标准中都把细胞毒性试验列为首位，作为首选项目。山东省医疗器械产品质量检验中心概述n定义：该试验采用已建立的细胞系（ATCC CCL1(NCTC clone 929)）, 测定由器械、材料和/或其浸提液造成的细胞溶解(细胞死亡)、以及对细胞生长的抑制和其他影响。n意义：该试验属体外试验，能在短期内检出供试品对细胞新陈代谢功能的影
12、响，对毒性物质具有较高的敏感性，从而能快速筛选材料。因此，细胞毒性试验为生物学试验中首选试验项目。山东省医疗器械产品质量检验中心（一）评价类型简介 n医疗器械的细胞毒性可以有以下二种评价类型：n1. 按不同生物学终点评价 n (1) 细胞形态学评价：定性检测方法，结果评价相对比较初浅，通常仅作为一种辅助或补充的方法。n (2) 细胞膜效应评价：中性红染色法，台盼兰染色法，荧光素染色法等。n (3) 细胞生长能力评价：细胞增殖度测定。n (4) 细胞代谢特性评价：法、各种测定细胞总蛋白量，蛋白质合成率和酶活性的方法。山东省医疗器械产品质量检验中心n2. 按不同接触方式评价n (1) 浸提液方式：
13、将供试品浸在介质介质中，经过一定的时间和温度的作用，取其浸提液与培养的细胞接触。n(2) 直接接触方式：将供试品直接与培养的细胞接触。n(3) 间接接触方式：将细胞与供试品隔开，在该体系中上层的供试品可以通过中间介质中的孔隙影响下层的细胞。包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验。山东省医疗器械产品质量检验中心常用的细胞毒性试验nMTT （四唑盐）法：哺乳动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。n该试验用于细胞毒性定量评价。n对该试验有干扰的供试品不适于本试验。对该试验有干扰的供试品不适于本试验。山
14、东省医疗器械产品质量检验中心浸提方法n常用浸提方法举例：按照4g/20ml浸提介质的比例，浸提介质为含血清的细胞培养基，（371），（242）h。n注意：浸提液接触细胞之前，如果进行过滤、离心等处理，应详细记录并对这些步骤加以说明。宜避免对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。 山东省医疗器械产品质量检验中心细胞毒性结果分析n定性评价：分级达到2级以上时被认为有细胞毒性效应。 n定量评价： 细胞活性下降大于 30%被认为有细胞毒性反应。 山东省医疗器械产品质量检验中心细胞毒性结果评价n细胞毒性仅仅是一种最初的信号，它预示存在体内毒性的可能性，事实上单凭细胞毒性数据还未必能
15、确定该器械一定不适用于特定的临床应用n在对细胞毒性的结果评价时需要结合其他生物相容性数据和产品的预期用途进行综合评价。n在解释试验数据时还必须考虑到该试验系统的局限性。山东省医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心刺激试验刺激试验n刺激是不涉及免疫学机制的一次、多次或持续与试验材料接触所引起的局部炎症反应。n要测定器械、材料及其潜在可溶出物的刺激作用，试验的进行应与使用或接触的途径和持续时间相适应。n刺激试验具有较高的敏感性，是医疗器械三项基本生物学评价项目之一。 山东省医疗器械产品质量检验中心刺激试验类型n皮肤刺激n皮内反应n特殊的刺激试验：眼、口腔、阴茎、直肠和阴道刺激等山东
16、省医疗器械产品质量检验中心注：n任何显示为皮肤刺激物或pH2.0或11.5的材料也不宜再进行试验，宜标示为潜在的眼刺激物。 n任何已显示为皮肤或眼的刺激物，或pH2.0或11.5的材料不应再进行试验，可标示为潜在的口腔、阴茎、直肠、阴道组织组织刺激物。n任何显示为皮肤、眼、黏膜组织刺激物的材料，或是pH2.0或11.5的材料，不应进行皮内试验。山东省医疗器械产品质量检验中心皮皮 内内 反反 应应山东省医疗器械产品质量检验中心试验结果评价 n 对一些广泛应用于人体正常或损伤皮肤的产品,一般不允许对皮肤有实质性危害存在。n在某些情况下，阳性试验剂量不一定就判定材料不能使用。山东省医疗器械产品质量检
17、验中心致敏试验n定义：免疫介导的对某种物质的皮肤反应。n该试验属体内试验，方法学相对比较成熟，灵敏性较高，因此为各类医疗器械必须评价的项目之一。 山东省医疗器械产品质量检验中心方法n最大剂量法n封闭斑贴法n小鼠局部淋巴结试验（LLNA） 山东省医疗器械产品质量检验中心试验结果评价n按本标准试验步骤得出的试验结果不能单独成立。n阴性试验结果往往不能排除产品可能导致皮肤过敏反应的可能性。n出现阳性试验结果有时不一定就表明器械或材料不能使用。山东省医疗器械产品质量检验中心全身毒性试验 急性全身毒性急性全身毒性亚急性全身毒性亚急性全身毒性亚慢性全身毒性亚慢性全身毒性慢性毒性慢性毒性热原反应热原反应重复
18、接触全身毒性试验重复接触全身毒性试验 山东省医疗器械产品质量检验中心定义n急性全身毒性：在急性全身毒性：在24h24h内一次、多次或持续接触试验样品内一次、多次或持续接触试验样品后在任何时间发生的不良作用。后在任何时间发生的不良作用。注：与药典上的异常毒性试验不注：与药典上的异常毒性试验不同。同。n亚急性全身毒性：在亚急性全身毒性：在24h24h28d28d内多次或持续接触试验样品内多次或持续接触试验样品后发生的不良作用。后发生的不良作用。n亚慢性全身毒性：反复或持续接触试验样品后在动物寿命亚慢性全身毒性：反复或持续接触试验样品后在动物寿命期的某一阶段发生的不良作用。期的某一阶段发生的不良作用
19、。n慢性全身毒性：在动物的主要寿命期内反复或持续接触试慢性全身毒性：在动物的主要寿命期内反复或持续接触试验样品后发生的不良作用。验样品后发生的不良作用。山东省医疗器械产品质量检验中心重复接触全身毒性试验 山东省医疗器械产品质量检验中心n接触途径n接触剂量n接触时间山东省医疗器械产品质量检验中心接触途径n GB/T 16886.11-2011中规定，医疗器械或其可沥滤物可通过多种接触途径进入人体，亚慢性（亚急性）全身毒性试验最好采用具有临床相关性的接触途径，如采用其他接触途径应予以论证。n接触方式有皮肤、植入、吸入、皮内、肌内、腹腔、静脉、经口、皮下等。山东省医疗器械产品质量检验中心接触剂量 n
20、对于较长期试验，宜包括至少三种剂量水平和适当的对照组。n采用一种适宜的试验样品剂量进行单剂量组试验可判定是否存在毒性危害（即限度试验），但其他多剂量或剂量反应试验要求多个剂量组来判定毒性反应。n如准备采用加严剂量，可增加剂量组。 山东省医疗器械产品质量检验中心n剂量频率：应具有临床相关性。在重复接触试验中，试验周期内动物最好每周7日接触试验样品。n剂量体积：GB/T 16886.11-2011中附录B规定试验样品接触最大剂量体积，但不应做为常规接触剂量的选择。山东省医疗器械产品质量检验中心结果评价n观察项目：体重变化、临床观察、临床病理学、大体病理学、器官称重、组织病理学等。n综合分析各指标，
21、判定是否具有“生物学相关性”。n应注意此类试验的局限性，对结果进行科学的判断。山东省医疗器械产品质量检验中心热原试验n致热性是某种化学制剂或其他能产生发热反应物质的一种特性。本部分所涉及的是材料介导的致热性。n常用方法是将材料浸提液由静脉注入兔内，在一定时间内观察兔体温变化，以判断在材料或浸提液中所含热原量是否符合人体应用要求。n只做该项试验尚不能区分热原反应是因材料本身还是因内毒素污染所致。只有同细菌内毒性试验相结合才能做出热原反应是否是因材料致热性所致。 山东省医疗器械产品质量检验中心内毒素介导的致热性n这种致热形式源自于革兰氏阴性细菌的生物活性内毒素，通常为医疗器械制造过程中的诱导发热的
22、污染物，可采用特异性细菌内毒素试验（鲎试剂法）测定器械内毒素含量来进行评价。材料介导的致热性n该类型致热性为非内毒素相关因素引起， 山东省医疗器械产品质量检验中心n一般认为，热原试验主要适用于与循环血液接触的器械。nASTM规定，与中枢神经系统和胸腔接触的器械也要进行热原试验。注：热原试验是静脉注射，需要考虑浸提液的状态。山东省医疗器械产品质量检验中心遗传毒性n试验目的：使用哺乳动物或非哺乳动物细胞培养或其他技术来测定由医疗器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变，以及其他DNA或基因毒性。 山东省医疗器械产品质量检验中心遗传毒性n实验策略：优先体外试验，方案1：细菌基
23、因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物细胞诱导性试验.方案2：细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验（覆盖诱裂性和基因突变）。 山东省医疗器械产品质量检验中心遗传毒性n实验策略：如果体外试验出现阳性，应进行体内诱变性试验。常用体内试验包括啮齿动物微核试验、啮齿动物骨髓中期分析、哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验。 山东省医疗器械产品质量检验中心血液相容性n试验目的：血液相容性试验用一个相应的模型或系统评价与血液接触的医疗器械或材料对血液或血液成分的作用。 山东省医疗器械产品质量检验中心血液相容性n试验方法：血栓形成、凝血、血小板、血液学（溶血、白细胞计数、白细胞活化、网织红细胞计数
24、）、补体系统 山东省医疗器械产品质量检验中心血液相容性n溶血试验： 供试品的溶血率应小于5% 。 血山东省医疗器械产品质量检验中心生殖毒性试验 n试验目的：评价试验样品对生殖功能、胚胎发育（致畸性）以及胎儿和早期婴儿发育潜在影响。 山东省医疗器械产品质量检验中心生殖毒性试验n可能需要进行生殖及发育毒性试验的材料或器械： 1. 与生殖组织或胚胎（胎儿）直接长期或永久接触的器械。 2. 储能医疗器械。 3. 可吸收材料或可溶出物质。（如在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或者材料或医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无生殖和发育毒性时，就无需进行试验。山东省医疗器械产品质量检验中心6060重
25、点试验山东省医疗器械产品质量检验中心内 容细胞毒性试验细胞毒性试验 1植入后局部反应试验植入后局部反应试验2刺激和致敏试验刺激和致敏试验3山东省医疗器械产品质量检验中心细胞毒性的定义n根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义,细胞毒性是指由产品、材料及其浸提物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。nISO10993.5-2009的定义： Cytotoxicity is an irreversible damage to living cells. 对活细胞不可逆的损害。山东省医疗器械产品质量检验中心n细胞毒性试验是运用哺乳动物细胞体外培养技术，检测医疗器械/材料引起的细胞生长抑制
26、，溶解死亡等毒性作用。山东省医疗器械产品质量检验中心体外细胞毒性试验的特点n对毒物高度敏感。n试验周期短，可用于快速筛选。n试验方法标准化，试验结果重复性好，便于实验室之间的结果比对。山东省医疗器械产品质量检验中心n体外细胞毒性试验具有通用性, 广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。山东省医疗器械产品质量检验中心琼脂扩散琼脂扩散滤膜扩散滤膜扩散细胞毒性试验细胞毒性试验浸提液试验浸提液试验直接接触试验直接接触试验间接接触试验间接接触试验定性定性 显微镜观察法显微镜观察法 MTT XTT 中性红摄取中性红摄取 集落形成集落形成 定量定量ISO10993.5-2009山东省医疗器械产品质量检验中心IS
27、O 10993-5:2009和GB/T16886.5-2003(ISO 10993-5:1999)的区别n新标准修订内容如下：n修改了“材料浸提液的制备”、“试验步骤”“结果评价”等相关内容，给出了细胞毒性定性和定量评价指标；n增加了“附录A中性红摄取(NRU)细胞毒性试验”；n 增加了“附录B 集落形成细胞毒性试验”；n 增加了“附录C MTT细胞毒性试验”；n 增加了“附录D XTT细胞毒性试验”。 山东省医疗器械产品质量检验中心细胞毒性测定中所使用的大量终点测定方法可分成以下评价类型：n 按形态学方法评定细胞损伤；n 细胞损伤的测定；n 细胞生长的测定；n 细胞代谢特性的测定。山东省医疗
28、器械产品质量检验中心ISO10993-5:2009术语和定义 n近汇合 subconfluency 在对数生长期末，约80%的细胞融合。 n空白 blank 不含试验样品的浸提介质，浸提期间置于与试验样品相同的器皿中，并经受与试验样品相同的条件。 山东省医疗器械产品质量检验中心浸提液试验浸提液试验结果的重现性稳定。样品与其他类似器械或材料的结果在实验室内部和各实验室间的水平上具有可比性。 浸提液试验被普遍认可。山东省医疗器械产品质量检验中心a) 含血清培养基;b) 生理盐水溶液;c) 其他适宜的介质。 含血清培养基是首选的浸提介质，优先选用含血清培养基用于浸提是由于其具有支持细胞生长以及浸提极
29、性和非极性两种物质的能力。 除了含血清培养基，在明确要浸提极性物质（例如离子化合物）时宜考虑采用无血清培养基。其他适宜的介质包括水和二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中, DMSO如高于0.5（体积分数）时有细胞毒性。与含血清培养基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀释度较大，溶出物的细胞接触浓度会比较低。 浸提介质浸提介质山东省医疗器械产品质量检验中心 含血清培养基按照a) （371）规定的浸提条件，因为浸提温度超过（371）会对血清化学和/或血清稳定性以及培养基中其他成分产生不良影响。 浸提液接触细胞之前，如果进行过滤、离心或用其他方法处置，最终报告中对此应详细记录并对这些步骤加以说明
30、，对浸提液pH值的调整也应在报告中说明。宜避免对浸提液进行处理，例如对pH值的调整，因为这会影响到试验结果。浸提条件山东省医疗器械产品质量检验中心 细胞系n优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取。n若贮存某一原种培养细胞系时, 则应将其放在相应培养基内, 在80或80以下冻存，培养基内加有低温防护剂, 如二甲基亚砜或甘油。长期贮存（数月至数年）只能在130或130以下冻存。山东省医疗器械产品质量检验中心培养基 n培养基应无菌。n含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。n培养基中可含有对试验无不良作用的抗生素。山东省医疗器械产品质量检验中心 原种培养细胞制备n用选定的细胞系和培养基制
31、备试验所需的细胞。使用存储细胞时, 如加有低温防护剂要除去, 使用前至少传代培养一次。 n传代培养细胞时, 采用适合细胞系的酶分散法和/或机械分散法。山东省医疗器械产品质量检验中心 试验步骤 n 平行样数 应至少采用三个平行试验样品数和对照品数。 浸提液试验 n本试验用于细胞毒性定性和定量评定。n试验宜在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。 n试验开始前用显微镜验证培养细胞的近汇合和形态学情况。n经过至少24h的培养后，确定细胞毒性反应。山东省医疗器械产品质量检验中心 细胞毒性的测定 n可采用定性或定量方法测定细胞毒性反应。n定性评价: 用显微镜检查细胞，必要时采用细胞化学染色，评价诸如一般形
32、态、空泡形成、脱落、 细胞溶解和胞膜完整性等方面的改变。在试验报告中应描述性地或以数字记录正常形态的变化，表1给出了用于对试验样品分级的方法。 山东省医疗器械产品质量检验中心表1 浸提液细胞毒性形态学定性分级级别反应程度全部培养细胞观察0无无胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解，无细胞增殖下降胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解，无细胞增殖下降情况情况1极轻微极轻微 不超过不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解；仅观粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解；仅观察到极轻微的细胞生长抑制现象。察到极轻微的细胞生长抑制现象。2轻度轻度不
33、超过不超过50%的细胞呈圆缩、无胞浆内颗粒，无大范的细胞呈圆缩、无胞浆内颗粒，无大范围细胞溶解；可观察到不超过围细胞溶解；可观察到不超过50%的细胞生长抑制的细胞生长抑制现象。现象。3中度中度不超过不超过70%的细胞层包含圆缩细胞或溶解细胞；细的细胞层包含圆缩细胞或溶解细胞；细胞层未完全破坏，但可观察到超过胞层未完全破坏，但可观察到超过50%的细胞生长的细胞生长抑制现象抑制现象4重度重度细胞层几乎完全或完全破坏细胞层几乎完全或完全破坏山东省医疗器械产品质量检验中心正常开始正常开始正常中正常中间间正常结束正常结束山东省医疗器械产品质量检验中心阴性对照阴性对照空白对照空白对照阳性对阳性对照照山东省
34、医疗器械产品质量检验中心山东省医疗器械产品质量检验中心浸提液试验的定量评价n定量评价: 测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞增殖或克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放、活体染料的还原或其他可测定的参数进行定量测试。试验报告中应记录使用的方法和反应。nISO10993-5：2009规定细胞活性下降大于 30%被认为有细胞毒性反应。山东省医疗器械产品质量检验中心ISO10993-5 ：2009附录C（资料性附录） MTT 细胞毒性试验n原理 通过细胞代谢活性测定细胞的存活率。 MTT黄色水溶液 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di
35、phenyltetrazoliumbromid)在活细胞内代谢性减少，生成蓝紫色不可溶的甲瓒。甲瓒溶于异丙醇后用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。山东省医疗器械产品质量检验中心试验步骤n 基本步骤 nL929细胞接种至96孔板，维持培养24h（1倍周期），至形成半汇合单层。然后与系列浓度试验化合物接触。接触24h后测定每一试验浓度甲瓒形成，与对照培养细胞的甲瓒形成进行比较。计算每一试验浓度生长抑制百分比。山东省医疗器械产品质量检验中心材料n试验用细胞系n采用L929细胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection ATCC
36、, Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，试验用细胞应无支原体感染。山东省医疗器械产品质量检验中心试验质量检查（）:阳性对照(PC)和阴性对照(NC) 山东省医疗器械产品质量检验中心试验质量检查（）：空白n未经处理空白的光密度（OD570）绝对值可表明，在试验的两天内以每孔1104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。n空白OD570平均值如0.2，则试验符合接受标准。n为了检查细胞接种系统误差，将空白加
37、到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧。n左、右两列空白平均值与全部空白平均值相差如不大于15%，则试验符合接受标准。n对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价则可免除两列空白的操作。山东省医疗器械产品质量检验中心MTT细胞毒性试验操作流程时间 h步骤00:00接种接种96孔板：孔板：1104个细胞个细胞/100LMEM培养基培养基/孔孔孵育（孵育（37/5%CO2/22h至至26h）24:00除去培养基除去培养基24:00加入用试验用培养基制备的加入用试验用培养基制备的4个浓度的试验样品浸提液个浓度的试验样品浸提液（100L）(未处理空
38、白未处理空白=试验用培养基试验用培养基)孵育（孵育（37/5%CO2/24h）山东省医疗器械产品质量检验中心48:00形态学改变的显微镜评价除去培养基加入50LMTT溶液孵育（37/5%CO2/2h）51:00除去除去MTT溶液溶液每孔加入每孔加入100L异丙醇异丙醇震荡滴定板震荡滴定板51:30在在570nm测量吸光度（参照测量吸光度（参照650nm）山东省医疗器械产品质量检验中心数据记录n试验样品（100%浸提液）组试验细胞存活率下降至如空白组试验细胞存活率的70%，则具有潜在的细胞毒性。山东省医疗器械产品质量检验中心ISO10993-5：2009附录D（资料性附录） XTT细胞毒性试验n
39、原理n通过线粒体脱氢酶的测定反应细胞的存活率。nXTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl -2H-tetrazolium hydroxide)与线粒体脱氢酶反应，生成水溶性甲瓒。用分光光度计测定的色度与活细胞数目相关。山东省医疗器械产品质量检验中心n细胞系n采用L929细胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection ATCC, Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Col
40、lection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，细胞培养物应无支原体。山东省医疗器械产品质量检验中心试验质量检查（）:阳性对照(PC)和阴性对照(NC) n每项细胞毒性试验都包括阳性对照和阴性对照。山东省医疗器械产品质量检验中心试验质量检查（）：空白n未经处理空白的光密度（OD450）绝对值可表明，在试验的两天内以每孔1104接种的细胞是否以正常的倍增时间以指数方式增长。n空白OD450平均值如0.2，则试验符合接受标准。n为了检查细胞接种系统误差，将空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧.n左、右两列空白平均
41、值与全部空白平均值相差如不大于15%，则试验符合接受标准。n对于细胞接种误差的检查，也可以通过相差显微镜检查每块板，以确保细胞数量一致。采用显微镜评价则可免除两列空白的操作。山东省医疗器械产品质量检验中心XTT细胞毒性试验操作流程时间 h 步骤00:00接种接种96孔板：孔板：1104个细胞个细胞/100LMEM培养基培养基/孔孔孵育（孵育（37/5%CO2/22h至至26h）24:00除去培养基除去培养基24:00加入用试验用培养基制备的加入用试验用培养基制备的4个浓度的试验样品个浓度的试验样品浸提液（浸提液（100L）(未处理空白未处理空白=试验用培养基试验用培养基)孵育（孵育（37/5%
42、CO2/24h）山东省医疗器械产品质量检验中心48:00形态学改变的显微镜评价加入50LXTT/PMS溶液孵育（37/5%CO2/3h5h）51:00震荡平板震荡平板每孔中吸出每孔中吸出100L加到新平加到新平板中板中51:30在在450nm测量吸光度（参照测量吸光度（参照630nm）山东省医疗器械产品质量检验中心数据分析n活细胞数减少是由于样品中线粒体脱氢酶总活性降低，这直接与生成的橙色甲瓒量有关，在450nm测量光密度。与空白比较计算存活率下降情况。山东省医疗器械产品质量检验中心数据记录n试验样品（100%浸提液）组试验细胞存活率下降至如15）n与阴性对照样品比较组织反应。山东省医疗器械产
43、品质量检验中心生物降解试验n参考标准：GB/T16886.6n试验周期应与植入部位、植入物的尺寸、估计的降解时间相关。山东省医疗器械产品质量检验中心可降解/可吸收性材料植入周期和组织反应的基本考虑n应对植入物各时间点与降解过程相关的局部组织反应进行评价（不推荐单一的植入时间点）：na)发生降解时；nb)中期降解阶段；nc)达到稳定状态时，组织恢复或接近完全降解（一般需要达到或超过吸收终点，即完成预期的重塑和修复的最终组织反应或生物反应恢复至正常组织学）。山东省医疗器械产品质量检验中心刺激与皮肤致敏试验 山东省医疗器械产品质量检验中心ISO 10993-10:2010和GB/T16886.10-
44、2005(ISO 10993-10:2002)的区别n新标准修订内容如下：n修改了标准名称；n修改了术语和定义；n取消了原“5.4材料鉴别”；n皮内反应试验由附录B调整到正文中；n人体皮肤刺激试验方法由正文调整到附录C；n皮肤致敏试验增加小鼠局部淋巴结检验法；n增加了附录D体外皮肤刺激试验；n增加了附录E聚合物试验材料浸提液制备方法。山东省医疗器械产品质量检验中心皮肤致敏试验山东省医疗器械产品质量检验中心概念n皮肤致敏 skin sensitization变应性接触性皮炎。免疫介导的对某种物质的皮肤反应。n是一种免疫应答反应。山东省医疗器械产品质量检验中心目前三种测定化学物潜在皮肤致敏性的动物
45、试验n最大剂量致敏试验(GPMT)n封闭式贴敷试验(Buehler试验)n小鼠局部淋巴结试验（LLNA）山东省医疗器械产品质量检验中心皮肤致敏试验皮肤致敏试验GPMTBTLLNA皮肤评分皮肤评分致敏性评价致敏性评价BrDU淋巴细胞淋巴细胞分析分析山东省医疗器械产品质量检验中心皮肤致敏试验 n豚鼠最大剂量试验(GPMT)：最敏感的方法n封闭式贴敷试验(Buehler试验)：适用于局部应用产品。n小鼠局部淋巴结试验（LLNA）：豚鼠试验的唯一替代试验，用于检验单一化学物，并且目前为化学物的首选测定法。n注：全部三种方法被开发用于测定化学物的致敏潜能，即接触性皮炎、迟发型（型）超敏反应 山东省医疗器
46、械产品质量检验中心最大剂量致敏试验(GPMT)n经皮内注射诱导，斑贴激发的方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应，以评价样品是否具有引起迟发性超敏反应的潜能。山东省医疗器械产品质量检验中心最大剂量致敏试验适用范围n适用于评价与人体接触所有类型的产品及其浸提液。山东省医疗器械产品质量检验中心最大剂量致敏试验过程n皮内诱导阶段（试验样品皮下注射）7天后n局部诱导阶段（试验样品敷贴48小时）14天后n激发阶段（试验样品敷贴24小时） n结果观察24小时和48小时。山东省医疗器械产品质量检验中心Magnusson 和Kligman分级敷贴试验反应敷贴试验反应 等级等级
47、 无明显改变无明显改变 0 0散发性或斑点状红斑散发性或斑点状红斑 1 1中度融合性红斑中度融合性红斑 2 2重度红斑和重度红斑和/ /或水肿或水肿 3 3山东省医疗器械产品质量检验中心GPMT 阳性试验 （ 0.1%DNCB ）山东省医疗器械产品质量检验中心 结果评价n按Magnusson 和Kligman分级标准，对照组动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物分级大于或等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。山东省医疗器械产品质量检验中心小鼠局部淋巴结试验（LLNA） n在小鼠耳背部局部处置某一试验样品后，测定鼠耳应用部位引流淋巴结内淋巴细
48、胞的增殖程度。指定某种试验材料为致敏物，其临界值是与对照活性比较细胞增殖应答为3倍或更多。山东省医疗器械产品质量检验中心封闭贴敷试验(Buehler试验) n采用封闭斑贴诱导，激发方式将试验材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应，以评价样品是否具有引起迟发性超敏反应的潜能。山东省医疗器械产品质量检验中心封闭贴敷致敏试验适用范围n适用于预测中度至重度致敏物，不能采用最大剂量致敏试验法的样品或接触表皮的样品。山东省医疗器械产品质量检验中心封闭贴敷致敏试验过程n诱导阶段（一周敷贴3次，每次6小时。连续3周）n14天后n激发阶段（试验样品换位敷贴6小时） n结果观察24小时和4
49、8小时。山东省医疗器械产品质量检验中心 结果评价n同最大剂量致敏试验山东省医疗器械产品质量检验中心 刺试激验山东省医疗器械产品质量检验中心定义n刺激 (irritation)：一次、多次或持续与一种物质（材料）接触所引起的局部非特异性炎症反应。n注：皮肤刺激是一种可逆反应，主要以皮肤红斑（发红）为特征。n 非免疫应答反应。山东省医疗器械产品质量检验中心分类n皮肤刺激n皮内反应n粘膜刺激l阴道刺激阴道刺激l直肠刺激直肠刺激l阴茎刺激阴茎刺激l口腔粘膜刺激口腔粘膜刺激n眼刺激山东省医疗器械产品质量检验中心n首选试验动物为家兔n口腔粘膜刺激试验动物为金黄地鼠动物选择山东省医疗器械产品质量检验中心动物
50、皮肤刺激试验n采用相关动物模型对材料在试验条件下产生皮肤刺激反应的潜能做出评定。n模拟样品临床使用 ，将样品或样品浸提液直接贴敷于动物皮肤上，在规定的时间内观察动物皮肤反应，以评价样品是否具有潜在的皮肤刺激作用。山东省医疗器械产品质量检验中心动物皮肤刺激试验适用范围n适用于预期与人体正常或损伤皮肤接触的医疗器械和材料山东省医疗器械产品质量检验中心动物皮肤刺激试验n试验动物l健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一品系，健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一品系，体重不低于体重不低于2kg。n使用数量l3 只只l如预期有刺激反应，初试应考虑使用如预期有刺激反应，初试应考虑使用1只动物。只动物。 除非出