色谱法分离原理教案.doc-淘文阁

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1、学习好资料欢迎下载YOUR LOGO原创文档请勿盗版第十四章色谱法分离原理一教学内容1. 色谱分离地基本原理与基本概念2. 色谱分离地理论基础3. 色谱定性与定量分析地方法二重点与难点1. 塔板理论，包括流出曲线方程、理论塔板数 ( n ) 及有效理论塔板数( n e f f ) 与塔板高度 ( H) 及有效塔板高度 ( He f f ) 地计算2. 速率理论方程3. 分离度与基本分离

2、方程积极向上三教学要求，探索.熟练掌握色谱分离方法地原理自己.掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表地各种技术参数地准确含义本身.能够利用塔板理论与速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素价4.学会各种定性与定量地分析方法值，学业四学时安排4学时有成第一节概述色谱法早在 9 0 年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶地色素成

3、分时，将植物叶子地萃取物倒入填有第 23 页，共 24 页碳酸钙地直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色地谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质地分离， “ 色谱 ” 二字虽已失去原来地含义 . 但仍被人们沿用至今。在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动地一相（固体

4、或液体）称为固定相；自上而下运动地一相（一般为气体或液体）称为流动相；装有固定相地管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质与结构上地差异，与固定相相互作用地类型、强弱也有差异，因此在同一推动力地作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而

5、按先后不同地次序从固定相中流出。从不同角度，可将色谱法分类如下：.按两相状态分类积极气体为流动相地色谱称为气相色谱（ GC）向上根据固定相为固体吸附剂还为固定液（附着在惰性载体上地，探一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（ GSC）与气液色谱索自（ GLC）。液体为流动相地色谱称液相色谱（ LC）己本同理液相色谱亦可分为液固色谱（

6、LSC）与液液色谱（ LLC）。身价超临界流体为流动相地色谱为超临界流体色谱（ SFC）。随着色谱值，工作地发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键学业合固定相地色谱又称化学键合相色谱（ CBPC） .成有.按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上地吸附能力强弱不同而得以分离地方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶

7、解度不同而达到分离地方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上地亲与力大小不同而达到分离地方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同地分子在多孔固定相中地选择渗透而达到分离地方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）地高专属性亲与力进行分离地技术称

8、为亲与色谱法，常用于蛋白质地分离。3. 按固定相地外型分类固定相装于柱内地色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状地色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱与纸色谱。4. 按照展开程序分类按照展开程序地不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、与迎头法。洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组

9、分弱得多地气体或液体作冲洗剂。积极由于各组分在固定相上地吸附或溶解能力不同 . 被冲洗剂带出地先向上后次序也不同，从而使组分彼此分离。，探这种方法能使样品地各组分获得良好地分离，色谱峰清晰。此索自外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高地物质。目前，这种方法为色己本谱法中最常用地一种方法。身价顶替法为将样品加到色谱柱头后，在惰性流

10、动相中加入对固定值，相地吸附或溶解能力比所有试样组分强地物质为顶替剂（或直接用学业顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力地强成有弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱地组分最先流出，最强地最后流出。此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点为经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱与，

11、必须更换柱子或除去被柱子吸附地物质后，才能再使用。迎头法为将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱地组分首先一纯物质地状态流出，其次则以第一组分与吸附或溶解能力较弱地第二组分混合物，以此类推。该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质地混合物中切割出一个高纯组分（组

12、分 A），而不适用于对混合物进行分离。第二节色谱流出曲线及有关术语（一）色谱流出曲线与色谱峰由检测器输出地电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就为色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）地线性范围内，则色谱峰为对称地。（二）基线在实验操作条件

13、下，色谱柱后没有样品组分流出时地流出曲积线称为基线，稳定地基线应该为一条水平直线。极向（三）峰高上，色谱峰顶点与基线之间地垂直距离，以（ h）表示。探索基线（ a）自己峰高（ h）本身（四）保留值价值.死时间 t 0，学不被固定相吸附或溶解地物质进入色谱柱时，从进样到出现峰业有极大值所需地时间称为死时间，它正比于色谱柱地空隙体积，成因为这种物

14、质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长 L与 t 0 地比值计算，即=L/t02. 保留时间 t r试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过地时间，称为保留时间3. 调整保留时间 t r 某组分地保留时间扣除死时间后，称为该组分地调整保留时间，即t r =t rt 0由于组分在色谱柱中地保留时间 t r 包含

15、了组分随流动相通过柱子所须地时间与组分在固定相中滞留所须地时间，所以 t r 实际上为组分在固定相中保留地总时间。保留时间为色谱法定性地基本依据，但同一组分地保留时间常受到流动相流速地影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。4. 死体积 V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留地空间、色积极谱仪中管路与连接头

16、间地空间以及检测器地空间地总与。当后两相向3- 1上很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口地载气流速 Fc o，探（ cm索自己 mi n）计算。V0=t 0 Fc o本式中Fc o 为扣除饱与水蒸气压并经温度校正地流速。仅适用于身价气相色谱，不适用于液相色谱。值，5.保留体积 Vr学业指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过成有地流动相地体积。

17、保留时间与保留体积关系：Vr =t rFc o6. 调整保留体积 Vr某组分地保留体积扣除死体积后，称为该组分地调整保留体积。Vr= V rV0=t rFc o7. 相对保留值 r , 某组分地调整保留值与组分地调整保留值之比，称为相对保留值。r , =t r /tr =Vr /Vr 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此

18、，它在色谱法中，特别为在气相色谱法中，广泛用作定性地依据。在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（ s ），然后再求其它峰（ i ）对这个峰地相对保留值，此时可用符号表示，即=t r( i)/tr( s)式中 t r( i)为后出峰地调整保留时间，所以总为大于地。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性地指标，又称选择因子。( 五 )区域宽度色谱

19、峰地区域宽度为色谱流出曲线地重要参数之一，用于衡积极量柱效率及反映色谱操作条件地动力学因素。表示色谱峰区域宽度向上通常有三种方法。，探.标准偏差索自即 0. 60 7 倍峰高处色谱峰宽地一半。己本.半峰宽 W / 身价即峰高一半处对应地峰宽。它与标准偏差地关系为值，W / =.54学业.峰底宽度 W成有即色谱峰两侧拐点上地切线在基线上截距间地距离。它与标

20、准偏差地关系为W =4从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：( i )根据色谱峰地个数，可以判断样品中所含组分地最少个数；( i i)根据色谱峰地保留值，可以进行定性分析；( i ii)根据色谱峰地面积或峰高，可以进行定量分析；( i v)色谱峰地保留值及其区域宽度，为评价色谱柱分离效能地依据；( v )色谱峰两峰间地距离，为评价固定相（或流

21、动相）选择为否合适地依据。色谱分析地目地为将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间地距离必须足够远，两峰间地距离为由组分在两相间地分配系数决定地，即与色谱过程地热力学性质有关。第三节色谱法基本原理（一）分配系数 K与分配比 k. 分配系数 K分配色谱地分离为基于样品组分在固定相与流动相之间反复多次地分配过程，而

22、吸附色谱地分离为基于反复多次地吸附 - 脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间地分配来描述，而积描述这种分配地参数称为分配系数 K。极向它为指在一定温度与压力下，组分在固定相与流动相之间分上，配达平衡时地浓度之比值，即探索K= 溶质在固定相中地浓度/溶质在流动相中地浓度自己=Cs/Cm本身分配系数为由组分与固定相地热力学性质决定地

23、，它为每一价值个溶质地特征值，它仅与两个变量有关：固定相与温度。与两相体，学积、柱管地特性以及所使用地仪器无关。业有. 分配比k成分配比又称容量因子，它为指在一定温度与压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相与流动相中地质量比。即k= 组分在固定相中地质量/组分在流动相中地质量=ms/mmk 值越大，说明组分在固定相中地量越多

24、，相当于柱地容量大，因此又称分配容量或容量因子。它为衡量色谱柱对被分离组分保留能力地重要参数。 k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相地体积有关。k=ms/mm = Cs VS /CmVm式中 cs , cm分别为组分在固定相与流动相地浓度；Vm为柱中流动相地体积，近似等于死体积。 Vs 为柱中

25、固定相地体积，在各种不同地类型地色谱中有不同地含义。例如：在分配色谱中， Vs表示固定液地体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相地孔体积。分配比 k 值可直接从色谱图中测得（推导过程教材 P. 9 6 97 ）。k=(trt0)/t0 =tr/t0=V r/V04.分配系数 K与分配比k地关系K=k .积极其中称为相比率，它为反映各种色谱柱柱型特点地又一个参向上数。例如

26、，对填充柱，其值一般为 6 5 ；对毛细管柱，其值为，探60 6 00 。索自4.分配系数K及分配比k与选择因子地关系己本对 A、 B两组分地选择因子，用下式表示：身价 =tr( B)/tr(A )=k（ A）/k （ B）=K（ A）/值，K（ B）业学通过选择因子把实验测量值 k与热力学性质地分配系数 K直成有接联系起来，对固定相地选择具有实际意义。如果两组分地 K或 k 值相等，则 = ，两个

27、组分地色谱峰必将重合，说明分不开。两组分地 K或 k 值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同地分配系数为色谱分离地先决条件。图中 KAKB ，因此， A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离地增加，两峰间地距离逐渐变大，同时，每一组分地浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离为不利地，但又为

28、不可避免地。若要使 A、 B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分地分配系数必须有差异；第二，区域扩宽地速率应小于区域分离地速度；积第三，在保证快速分离地前提下，提供足够长地色谱柱。极第一、二点为完全分离地必要条件。作为一个色谱理论，它向上不仅应说明组分在色谱柱中移动地速率，而且应说明组分在移动过，探程中引起区域

29、扩宽地各种因素。塔板理论与速率理论均以色谱过程索自中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。己本（二）塔板理论身价把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板地概念来描述值，组分在两相间地分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率地学业指标，即色谱柱为由一系列连续地、相等地水平塔板组成。每一块有成塔板地高度用 H表示，称为塔板

30、高度，简称板高。塔板理论假设：1. 在柱内一小段长度 H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度 H。2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不为连续进行地，而为脉动式，每次进气为一个塔板体积（ Vm）。3. 所有组分开始时存在于第 0 号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4. 分配系数在所有塔板上为常数，与组

31、分在某一塔板上地量无关。简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板地方式向前移动。对于一根长为 L地色谱柱，溶质平衡地次数应为：n=L/Hn称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱地柱效随理论塔板数 n地增加而增加，随板高 H地增大而减小。塔板理论指出：第一，当溶质在柱中地平衡次数，

32、即理论塔板数 n大于 5 036时，可得到基本对称地峰形曲线。在色谱柱中， n值一般很大，如气相色谱柱地 n约为 00，因而这时地流出曲线可趋近于正态积极分布曲线。向上第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间地分配，探系数有微小差异，经过反复多次地分配平衡后，仍可获得良好地分索自离。己2本第三， n与半峰宽及峰底宽地关系式为：身价n=5.54 (tr

33、/W / )值= 6(tr/W)，式中 t r与 W / ( W )应采用同一单位（时间或距离）。从公式学业可以看出，在 t r一定时，如果色谱峰很窄，则说明 n越大， H越小，成有柱效能越高。2在实际工作中，由公式n = L /H与n = 5.5 4 (tr/W / )r= 6 ( t / W) 计算出来地地 n与 H值有时并不能充分地反映色谱柱地分离效能，因为采用 t R 计算时，没有扣除死时间 t M，所

34、以常用有效塔板数 n有效表示柱效：n有效 = 5.54 (tr/W / ) =6 (tr/W)有效板高：H有效=L/n有效因为在相同地色谱条件下，对不同地物质计算地塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。22例已知某组分峰地峰底宽为 40s ，保留时间为 40 0s，计算此色谱柱地理论塔板数。解：n=6 (tR/W)=6（ 40 0/40 ）=6 0

35、0块塔板理论为一种半经验性理论。它用热力学地观点定量说明了溶质在色谱柱中移动地速率，解释了流出曲线地形状，并提出了计算与评价柱效高低地参数。但为，色谱过程不仅受热力学因素地影响，而且还与分子地扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高地概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不

36、同地流速下，可以测得不同地理论塔板数，积极因而限制了它地应用。向上（三）速率理论，探9 56 年荷兰学者 va n D ee mt er （范第姆特）等在研究气液色谱索自时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理己本论中板高地概念，并充分考虑了组分在两相间地扩散与传质过程，身价从而在动力学基础上较好地解释了影响板高地各种因素。该理

37、论模值，型对气相、液相色谱都适用。va nDee mt er 方程地数学简化式为学业H=A+B/u+C u成有式中 u为流动相地线速度； A、 B、 C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。第三节色谱法基本原理1. 涡流扩散项A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子

38、在前进中形成紊乱地类似涡流地流动，故称涡流扩散。由于填充物颗粒大小地不同及填充物地不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱地相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰地变宽。色谱峰变宽地程度由下式决定：A= d p上式表明，A与填充物地平均直径 dp 地大小与填充不规则因子有关，与流动相地性质、线速度与

39、组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀地颗粒，并且填充均匀为十分必要地。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此 A = 0 。2. 分子扩散项 B / u （纵向扩散项）纵向分子扩散为由浓度梯度造成地。组分从柱入口加入，其浓度分布地构型呈 “ 塞子 ” 状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度， “ 塞子 ” 必然自发地向

40、前与向后扩散，造成谱带展宽。分积极子扩散项系数为B= Dg向上为填充柱内流动相扩散路径弯曲地因素，也称弯曲因子，探它反映了固定相颗粒地几何形状对自由分子扩散地阻碍情况。3- 1索自Dg 为组分在流动相中扩散系数（ cm己本分在流动相中扩散系数 Dg 成正比 .身价Dg 与流动相及组分性质有关：值 s） , 分子扩散项与组，( a)相对分子质量大地组分 Dg

41、小， Dg 反比于流动相相对分子质量地学业平方根，所以采用相对分子质量较大地流动相，可使 B项降低；有成( b)Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。3.

42、传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们地传质过程不完全相同。（）气液色谱传质阻力系数 C包括气相传质阻力系数 Cg 与液相传质阻力系数C 两项，即C=Cg +C气相传质过程为指试样组分从气相移动到固定相表面地过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有地分子还来不及进入两

43、相界面，22就被气相带走；有地则进入两相界面又来不及返回气相。这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数 Cg 为：Cg =0. 0 k/( +k )dp/D g式中 k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度积极dp 地平方成正比，与组分在载气流中地扩散系数 Dg 成反比。因此

44、，向上采用粒度小地填充物与相对分子质量小地气体（如氢气）做载气，探可使 Cg 减小，提高柱效。索自液相传质过程为指试样组分从固定相地气 / 液界面移动到液己本相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气 / 液界面身价地传质过程。这个过程也需要一定地时间，此时，气相中组分地其值，它分子仍随载气不断向柱口运动，于为造成峰形扩

45、张。液相传质阻学业力系数C 为：d2有成C = /k/(+ k ) f/Dl由上式看出，固定相地液膜厚度 d f 薄，组分在液相地扩散系数D 大，则液相传质阻力就小。降低固定液地含量，可以降低液膜厚度，但 k 值随之变小，又会使 C 增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体地比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大地载体来降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰

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