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1、生物技术与工程 第3章 基因工程2.2探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 教学设计一、教学目标的确定1、尝试进行PCR的基本操作。2、配制PCR反应体系。3、用电泳鉴定PCR的产物。二、教学重难点1、教学重点DNA片段的扩增及电泳鉴定。2、教学难点（1）配制PCR反应体系。（2）琼脂糖凝胶电泳。三、教学步骤（一）材料准备 试剂：可直接从公司购买商品化的PCR试剂盒，PCR反应体系的配方可参考教材或试剂盒的说明书；进行琼脂糖凝胶电泳操作需要准备的试剂有电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等。 用具：PCR仪（可选用科学研究用的PCR仪，也可选用水浴锅式教学用的PCR仪以直观呈现PCR反
2、应的过程）、电泳装置（包括电泳仪、连接线、电泳槽、制胶用的模具等）、微量离心管（根据所选的PCR仪来确定微量离心管的规格）、微量移液器、一次性吸液枪头等。（二）实施建议1. 配制PCR反应体系（1）在本实验中，需要使用微量移液器加入PCR反应体系的各个组分，让学生掌握正确的微量移液器的使用方法十分重要。移液时，应按照“容量设定吸液枪头安装预洗吸液枪头吸液放液卸去吸液枪头”六个步骤进行，一些关键步骤的操作规范如下。 吸液枪头安装：应采取旋转安装法，用力不能过猛。 吸液：先向下按压推动杆至第一停点，然后将吸液枪头垂直浸入液面，再平稳松开。 放液：将吸液枪头紧贴容器壁，先向下按压推动杆至第一停点，稍
3、作停顿后再按至第二停点，确保吸液枪头内没有液体残留。 在使用过程中，不能超量程使用微量移液器。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量移液器，从而减少实验过程中的交叉污染。（2）为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即最先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入Taq DNA聚合酶。（3）应按照教材或试剂盒说明书建议的体积加入各试剂，随意加大试剂用量并不会提高PCR扩增的成功率。例如，高浓度的引物可能引发错配，导致非特异性扩增；高浓度的4种脱氧核苷酸可能对扩增起抑制作用。用哺乳动物基因组DNA作模板时，建议在反应体系中加入1g模板
4、；用酵母菌、细菌基因组DNA和质粒DNA作模板时，建议在反应体系中分别加入10ng、1ng和1pg模板。（4）如果所选用的PCR仪没有加热盖，需要在PCR反应体系配制好后加入液体石蜡进行封闭，以防止加热过程中液体蒸发。2. 设置PCR仪的循环程序 教材给出的参考时间对绝大多数实验都是适用的。扩增1000bp片段的延伸时间一般设定为1min。教师可根据目的片段长度适当调整延伸时间。3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于
5、分子筛效应，即分子本身的大小和构象。在本实验中，主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。（1）制备琼脂糖凝胶时，当凝胶溶液冷却到不烫手时可加入核酸染料。科学研究中常用的核酸染料是溴化乙锭（EB），但由于它具有高致癌性，中学实验不建议使用，可用其他灵敏度高、毒性低的新型核酸染料替代它。（2）将凝胶放入电泳槽后，应确保加样孔内充满电泳缓冲液且没有气泡，否则会影响加样。（3）DNA分子可发生两性解离，当电泳缓冲液的pH大于其等电点时，DNA分子带负电；当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。一般使用的电泳缓冲液的pH为8，DNA分子带负电，向正极泳动。教师应提醒学生注意电极方向。4.
6、 结果分析见课件。（三）注意事项1. 为避免外源DNA等因素对实验结果的影响，建议在单独的实验室或者实验室中特定的区域进行本实验的相关操作。微量离心管、一次性吸液枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。2. 实验用到的酶、引物、模板DNA、4种脱氧核苷酸的混合液、扩增缓冲液等均需要分装成小份（避免反复冻融），并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块或PCR冷冻冰盒上缓慢融化。五、 课堂小结教材中提到在PCR反应体系中加入了四种脱氧核苷酸，这是作了简化处理、便于学生理解的表述。在实际操作时，加入的是四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）。这些分子都有三个磷酸基团，基团之间通过高能磷酸键相连。在DNA聚合酶催化新链合成的过程中，每掺入一个核苷酸，伴随着两个高能磷酸键的断裂，由此释放出来的能量可以满足核苷酸聚合反应的需求。学科网（北京）股份有限公司