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1、基因定点突变技术 基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。基因定点突变技术主要分为PCR定点突变技术和不依赖PCR的定点突变技术，这两类定点突变技术互为补充。1、PCR定点突变技术PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。（1）重叠延伸PCR重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如图3-9所示，该技
2、术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。（2）大引物PCR大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图3-10所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突
3、变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。2.不依赖PCR的定点突变技术 不依赖PCR的定点突变技术的核心是人工合成带有突变位点的寡核苷酸片段，再借助在宿主细胞内的复制过程来实现定点突变。这类技术中比较成熟的有盒式突变、寡核苷酸引导的突变等。盒式突变的原理是，利用一段人工合成的含有突变位点的双链寡核苷酸片段来替换目的基因中相应的片段，从而在目的基因中引入突变位点。寡核苷酸引导的突变的技术流程如图3-11所示。首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对）；然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生而来）进行杂交；继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体；最后将双链载体引入宿主细胞进行复制，并进行筛选和鉴定。学科网（北京）股份有限公司