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1、PCR引物的设计与应用尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性，但最关键的因素是引物的设计。引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火形成稳定结构时才能达到这个目标。引物设计主要遵循如下原则:(1) 引物的长度一般在1825b（base碱基），太短则特异性不够强，太长则退火温度会比较高。(2)弓|物G+C含量以40%60%为宜，太少扩增效果不佳，过多则易出现非特异条带。4种碱基最好随机分布。(3)两条弓|物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段。(4)一条引物自身不能有大于4 b的反向重复序列或自身互
2、补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。(5) 两条引物的退火温度相差不能大于5 C。如果相差太大， 操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。(6) 引物3端的性质非常关键，如果可能的话，最末及倒数第二个碱基的最佳选择是G或者C。(7 )实际应用中最重要的一点，设计的引物在合成之前，有必要在DNA数据库中进行BLAST检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。例、用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物、，其连接部位如图所示，x为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是右图中的 A. B.C. D. 【答案】D【解析】利用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，当引物与母链通过碱基互补配对结合后，子链延伸的方向总是从5端到3端，据此依题意和图示分析可知，A、B、C均错误，D正。学科网（北京）股份有限公司