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1、单基因病的诊断单基因病的诊断4遗传病的诊断遗传病的诊断 ( Diagnosis of Hereditary Disease) 可以分为产前诊断、症状前诊断和可以分为产前诊断、症状前诊断和现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗传咨询和防治工作的基础。开展遗传咨询和防治工作的基础。二、系谱分析二、系谱分析系谱系谱 ( Pedigree ) ：将患者家族的所有将患者家族的所有成员及其发病情况按照一定格式排绘制成成员及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就成为系谱。的图解，就成为系谱。系谱分析系谱分析 ( Pedigree Analysis ) ：对某对某种性
2、状或者疾病的多个系谱种性状或者疾病的多个系谱 进行综合研究，进行综合研究，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为系谱分析。称之为系谱分析。一例并指症的系谱一例并指症的系谱一例多指（趾）的系谱一例多指（趾）的系谱12 2341567123456一例一例-地中海贫血的系谱地中海贫血的系谱12213456789812345679101112设：贫血基因 0 正常基因 A A 0A 0A 0A A重型贫血重型贫血轻型贫血0 0A 0 12113764510912412813163421535610 11 12 13 14 15一例白化病的系谱一例白化病的系谱一例
3、甲型血友病的系谱21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 912一例抗维生素D性佝偻病的系谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91设：致病基因XA 正常基因XaXA XaXaYXAYXAXaXAY进行系谱分析应注意的问题进行系谱分析应注意的问题系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、外显不全等。性、外显不全等。分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相
4、区别。相区别。要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同观察指标会得出不同的结论。用不同观察指标会得出不同的结论。注意新的基因突变。注意新的基因突变。HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人正常人 携带着携带着 患者患者（致死）（致死） 无无 有有（50%） 有有（全部）（全部） 无无 有有（生存力强）（生存力强） - 基因型基因型 疾疾 病病 （隐性）（隐性）镰形细胞镰形细胞 （显性）（显性）抗抗 疟疟 疾疾 （显性）（显性）三、生物化学检查三、生物化学检查基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质与量的改变或者缺如。因此酶和蛋白
5、质的定量分析是诊断单基因病和先天性代谢性的主要方法。1. 代谢产物的检出代谢产物的检出酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接反映出酶的变化而作出诊断。反映出酶的变化而作出诊断。苯丙酮尿症苯丙酮尿症 ：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病粘多糖病 ：尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。DMD ：血清中的磷酸
6、肌酸酶活性。血清中的磷酸肌酸酶活性。2. 酶和蛋白质的分析酶和蛋白质的分析基因突变导致的单基因病主要是特定基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某些单基因病的主要方法。些单基因病的主要方法。检测材料的主要来源有：检测材料的主要来源有： 特定的组织和细特定的组织和细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。细胞等。注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织中都能够检测出来。例如苯丙氨
7、酸羟化酶组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。上海：上海：19811987年对年对284,396名新生儿进行名新生儿进行PKU筛查，查出筛查，查出PKU患儿患儿15名，高苯名，高苯丙氨酸血症丙氨酸血症4名。名。生物化学检查生物化学检查 苯丙酮尿症苯丙酮尿症, PKU酶活性检查酶活性检查 PAH 肝细胞肝细胞血液滤片法血液滤片法 Guthrie test 血液血液FeCl3显色反应显色反应 苯丙酮酸苯丙酮酸 尿液尿液四、基因诊断四、基因诊断基因分析，即基因诊断基因分析，即基因诊断 ( Gene Diagnosis )：
8、 是是利用利用DNA 分析技术直接从基因水平分析技术直接从基因水平 ( DNA or RNA ) 检测遗传病的基因缺陷。检测遗传病的基因缺陷。这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为式，所以又称为逆向诊断逆向诊断 ( Reverse Diagnosis )。基因诊断的优点基因诊断的优点材料容易获得，不受细胞类型的限制；材料容易获得，不受细胞类型的限制；不受基因表达的时
9、空限制。不受基因表达的时空限制。不受年龄的限制；不受年龄的限制；可以于发病前做出诊断；可以于发病前做出诊断；方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。出。 基因诊断的难点：基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。很大差异。 基因诊断的对象：基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。基因改变的多基因病。 至至1
10、997年，发现人类单基年，发现人类单基因病遗传病已达因病遗传病已达8587种，现已达到种，现已达到15988种种进行基因诊断必须具备的条件：进行基因诊断必须具备的条件：(1)致病基因的染色体定位已明确致病基因的染色体定位已明确(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)致病基因与致病基因与DNA多态存在连锁关系多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术基因诊断方法基因诊断方法 目前常用的基因诊断方法目前常用的基因诊断方法: (1)聚合酶链反应聚合酶链反应DNA扩增法扩增法 (2)限制性酶谱限制性酶谱Sou
11、thern印迹杂交直接分析法印迹杂交直接分析法 (3)限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法连锁分析法 (4)寡核苷酸探针寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)检测法检测法 (5)DNA测序测序 (6)基因芯片基因芯片（一）（一） 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）是在体外特异）是在体外特异和迅速地扩增特定靶和迅速地扩增特定靶DNA序列的方法序列的方法PCR的原理：的原理：1. 为可选择性扩增为可选择性扩增,要要有特异引物有特异引物2. 要有前身物、聚合要有前身
12、物、聚合酶和离子酶和离子3. 是链式反应，每一是链式反应，每一周期经过变性、复周期经过变性、复性和延伸三步性和延伸三步4. 一周期后一周期后DNA倍增倍增 PCR的过程：的过程： 变性（92-95；1分钟） 复性（40-60；1分钟） 延伸（72；1.5分钟） 5 3 3 5 变性变性 5 3 3 5 特异引物特异引物 复性复性 5 3 5 3 3 5 3 5 DNA聚合酶聚合酶 延伸延伸 3 5 5 3 PCR 以以 地贫基因诊断为例地贫基因诊断为例 由于中国人由于中国人地贫地贫80%以上为东以上为东南亚型缺失型南亚型缺失型 （- -SEA/）, 该突变的该突变的缺失范围约缺失范围约20kb
13、基因片段。因此，基因片段。因此， 采用跨越断裂点采用跨越断裂点PCR法（法（gap-PCR）,一次即可诊断出各种基因型。一次即可诊断出各种基因型。PCR的应用的应用1 21 21 2 3 4 5a b1：正常人；：正常人； 2,4,5：纯合体患者；：纯合体患者； 3：杂合体：杂合体(2的弟弟的弟弟)左为泳动变位模式：左为泳动变位模式：a 正常人；正常人；b 纯合体患者纯合体患者GAAGAGTGTTATCTCCAC PCR-DHPLCDHPLC（变性高效液相色谱）（变性高效液相色谱）进行基因突变检测的原理进行基因突变检测的原理 DHPLC进行基因突变检测是基于异源双进行基因突变检测是基于异源双链
14、的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程链的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。度不同。 一个杂合子个体，一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突产物一定含有野生型和突变型两种变型两种DNA，并且两者的比例为，并且两者的比例为1:1，将，将PCR产物进产物进行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，同样，当把野生型和突变型同样，当把野生型和突变型PCR产物混合后，进行变产物混合后，进行变性复性过程，杂交后会出现四种情况。性复性过程，杂交后会出现四种情况。 异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条
15、件下，就会在不匹配的碱基对处部分的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链解链，由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，带负电荷减少，结合力弱，因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。离，出现不同的检测峰。 DHPLC的特点：的特点： 1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟 2）自动化操作系统 3）准确测定DNA片段大小 4）基因突变检出率高，达95-100% 5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于
16、突变检测 （二）分子杂交（二）分子杂交 Southern印迹杂交印迹杂交 (Southern blot hybridization)原理原理: DNA碱基的替换和数目的改变可导碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变致限制性酶切片段长度改变 1. 点突变至酶切位点消失或出现新切点点突变至酶切位点消失或出现新切点 2. 较大片段碱基缺失较大片段碱基缺失 3. 串联重复数目较大的改变串联重复数目较大的改变 4. 较大片段碱基重复较大片段碱基重复限制酶的识别序列与切割：限制酶的识别序列与切割： 绝大多数绝大多数型限制酶的识别序列都是型限制酶的识别序列都是 回文结构回文结构, 即即以双对称轴
17、按以双对称轴按5 3方向阅读时方向阅读时,其碱基顺序在双链其碱基顺序在双链上相同上相同 BamH识别GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT- 3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA- 5 Bgl识别AGATCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5 探针的种类和标记 DNA 探针标记(probe labeling) 同位素标记: 32P, 35S, 3H 非同位素标记: 生物素，地高辛标记方法标记方法: 缺口平移 双链探针标记 随
18、机引物 PCR 寡核苷酸标记: 5末端标上标记物1限制性酶谱直接分析法：限制性酶谱直接分析法： 应用专一性基因探针和限制性内切酶，经应用专一性基因探针和限制性内切酶，经 Southern印迹杂交直接检测致病基因存在印迹杂交直接检测致病基因存在 原理：原理： 限制性内切酶能识别限制性内切酶能识别 DNA中特定核苷酸顺序，中特定核苷酸顺序，在正常情况下某种限制性内切酶所切出的片段在正常情况下某种限制性内切酶所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后长度是固定的，当基因发生突变后, 核苷酸顺序核苷酸顺序发生改变发生改变, 导致限制性内切酶的酶切位点改变，导致限制性内切酶的酶切位点改变，从而使片段长度
19、发生改变。从而使片段长度发生改变。/ / / - - / - - - - / - -4.7 kb3.0 kb? ASO点杂交点杂交(ASO dot hybridization) (ASO: allele-specific oligonucleotide)能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别原理：原理： 1. 点突变时突变点的碱基被替换点突变时突变点的碱基被替换 2. 设计分别与正常和点突变序列互补的探针设计分别与正常和点突变序列互补的探针 3. 单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳定稳定 4. 严格的洗脱条件
20、下严格的洗脱条件下,只有完全互补的异源杂交链能只有完全互补的异源杂交链能保留而显示杂交信号保留而显示杂交信号 A A ASO (N probe)5CTCCTGAGGAGA 3S ASO (M probe)5CTCCTGTGGAGAA 3221331 AA正常正常A S 杂合子杂合子ASO斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变A S杂合子杂合子S S纯合子纯合子DNA测序用四种不同颜色荧光素分别标记A，T，G，C核苷酸碱基，经过测序反应，标记的碱基代替原有碱基，通过标记碱基发出的荧光颜色确定待测DNA样本的序列。基因基因(DNA)芯片技术芯片技术将大量标记的探针分子（通常每平方将大量标记的探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于厘米点阵密度高于 400 ）固定于支持）固定于支持物上后与样品分子进行杂交，通过检物上后与样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息取样品分子的数量和序列信息