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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date微生物学实验指导(10.10)微生物学实验指导实验一 显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、 实验目的和内容（一）实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1学习油浸系物镜的使用方法。 2制作细菌染色装片。 3进行革兰氏染色法操作。 4用油镜观察大肠杆菌和苏云金
2、杆菌染色装片。二、 实验原理（一） 油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95、100等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线
3、的波长（）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比. 从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。 数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n1.0）与玻璃（n1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以
4、使物像明亮清晰。（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合
5、物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。三、实验材料和用具1. 菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。 2. 试剂革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。3. 仪器及用具显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 四、操作步骤(一) 细菌的革兰氏染色1. 制片 （1）涂菌 用无菌操作方法从平板中沾取菌苔一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1 cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 （2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火
6、焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。 （3）固定 将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色。2. 染色 （1）初染 于制片上滴加结晶紫染液，染1 min后，用水洗去剩余染料。 （2）媒染 滴加卢戈氏碘液，1 min后水洗。 （3）脱色 滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30 s 至1 min)，立即水洗。 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1 min，水洗。（5）镜检 用滤纸吸干，油镜镜检。 （二）镜检1. 观察前的准备 （1）将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4 cm。
7、坐正。 （2）调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。 2. 低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒，将细菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至装片0.5 cm处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心。3. 高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适
8、宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。 4. 油镜观察 （1）提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。 （2）从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。 （3）将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，直至视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物像必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。 （4）再次
9、观察，提起镜筒，换上另一块细菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察。绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 5. 镜捡完毕后的工作 （1）移开物镜镜头。 （2）取出装片。 （3）清洁油镜油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯，擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。 （4）擦净显微镜，将各部分还原；将接物镜呈“八“字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，阴凉干燥处存放。 (三) 结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色, 革兰氏阴性菌染成淡红色。 五、注意事项1细菌涂片务求均匀切忌过厚。2在
10、染色过程中，不可使染液干涸。 3脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 5使用油镜必须先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察的程序操作； 6下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作以免压碎玻片而损坏镜头。 7使用二甲苯擦镜头时，二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。 8注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。 六、实验报告1. 分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的大肠杆菌及金黄色
11、葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。 2. 记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析。 七、问题和思考 1涂片后为什么要进行固定，固定时应注意什么? 2. 用油镜便于观察细菌的依据是什么?3使用油镜应特别注意哪些间题？4当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求?实验二 放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察一、实验目的和内容（一）实验目的1. 辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态，学习放线菌的观察方法。2. 了解酵母菌形态结构。3. 了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。（二）实验内容1. 用插片法和水封片法观察放线菌的形态特征。 2. 观察酵母菌的个体形态和假菌丝。
12、 3. 曲霉、青霉、根霉形态观察。 二、实验原理放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌，常见放线菌大多能形成菌丝体。紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝（简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝处在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。通过设计各种培养和观察方法如插片法、
13、搭片法、玻璃纸法、印片法等，可保持放线菌自然生长状态下的形态特征，便于观察上述3种菌丝和孢子。酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，通常比常见细胞大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌
14、丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察；此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。三、实验材料和用具1. 菌株细黄链霉菌（Streptomyces micuoflavus）（又称5406），棘孢小单孢菌（Micromonuspora echinospora），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母
15、（Candida tropicalis），产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黑根霉（Rhizopus nigricans）。 2. 试剂0.1美蓝染色液、石炭酸复红染色液、0.05美蓝染色液（以pH6.0的0.02 mol/L磷酸缓冲液配制）、碘液、0.04的中性红染色液、5孔雀绿，0.5%沙黄液、95乙醇、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20甘油。3. 仪器及用具盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 透明胶带、剪刀、圆形滤纸片、细口滴管、镊子。 四、操作步骤() 放线菌的形态观察1. 观察自然生长状
16、态的放线菌用镊子小心取出用插片法培养的5406菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净，然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，分别用低倍镜、高倍镜观察, 找出3类菌丝及其分生孢子。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 2. 水封片观察 取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其分生孢子及基内菌丝。(二) 酵母菌的形态观察1酵母菌的活体染色观察及死亡率的测定 (1) 以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。 (2) 取0.05美蓝染色液1滴，置载玻片中
17、央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀3 min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母的个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。 (3) 在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5-6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 2. 酵母菌液泡系的活体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5 min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。 3酵母的假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在湿室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图4-1)，28培养2-3
18、d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图4-2)。 图2-1 酵母菌假菌丝的培养 图2-2 酵母菌的假菌丝形态 A藕节状假菌丝 B. 竹节状假菌丝(三) 霉菌观察1霉菌的形态观察 采用湿室培养法培养霉菌。可从培养16-20 h开始，连续观察，了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛雷、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否有分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。 2粘片观察 取一滴棉蓝染色液
19、置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。 3假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子以及两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。 五、注意事项1放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在培养操作中特别注意无菌操作，严防杂菌污染。 2通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。六、实验报告l绘制自然生长状态下放线菌的形态。2. 绘制酵母菌细胞。 3绘制根霉、青霉、曲霉形态图，标示各部分名称。 七、问题和
20、思考l用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?2酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?3. 什么叫载玻片湿室培养? 它适用于观察怎样的微小物，有何优点?附录: () 插片法和搭片法培养放线菌1插片法(图2-3A) (1) 制平板、接种用冷却至约50的高氏1号琼脂培养基倒平板（每皿约20 mL）。可用两种方法接菌：先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种（接种量可适当扩大）。先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。 (2) 插片及培养用无菌镊子取无菌盖玻片，在已经接种平板以
21、45角斜插入培养基内，插入深度约占盖玻片1/2的长度(图4-3A)。 同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5406菌孢子至盖玻片一侧的基部，但仅接种于其中央位置约占盖玻片宽度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧，将插片平板倒置于28，培养3-7d。 图2-3 放线菌的插片和搭片示意图A 插片法 B 搭片法2搭片法(图2-3B) (1) 开槽及接种用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种至洞内边缘。 (2) 搭片及培养在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置于28，培养3-7 d。 (二) 霉菌的培养1霉菌的载片湿室培养 （1）准
22、备湿室 在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一U形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎经121湿热灭菌30 min，置60烘箱中烘干，备用。 （2）取菌接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。 （3）加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60的培养基，滴加到载玻片的接种处培养基液应滴得圆而薄，其直径约为0.5 cm(滴加量一般以1/2小滴为宜)。 （4）加盖玻片 在培养基未彻底凝固之前, 用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖
23、玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁否则不透气。 （5）倒保湿剂 每皿倒入约3 mL 20的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润滑，以保持皿内湿度。皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28恒温培养3-5 d。 2黑根霉假根的培养（图2-4） 将融化的PDA培养基，冷却至50倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1/2，冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种， 然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28培养2-3 d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。 图2-4 根霉假根的培养实验三 培养基的配制、消毒和灭菌
24、一、实验目的和内容（一）实验目的1. 明确配制培养基的原理，了解消毒和灭菌的原理。2. 学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。3. 掌握各种灭菌方法的操作步骤。 （二）实验内容1牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的配制。 2高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法、过滤除菌法。 二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养基质。培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子及水分等。培养基还应具有适宜的pH、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。在液体培养基中加入0.5-1%的琼脂配制为半固体培养基，加入1-2%的琼脂配制为固体培养基。琼脂是
25、从石花菜等海藻中提取的多糖，是应用最广的凝固剂。琼脂在96-100融化，46以下凝固。培养基经灭菌后使用。培养基或其他液体的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又称湿热灭菌）。其原理是在密闭的高压灭菌锅中，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽，增加了灭菌器内的压力，从而使沸点提高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性达到完全灭菌的目的。培养用的玻璃器皿通常采用干热灭菌法。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热
26、灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12 h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中的细菌、真菌孢子等的方法，适用于酶液、抗生素等不耐热溶液的灭菌。三、 实验材料和用具1. 试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、1%链霉素溶液。2. 仪器及用具 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、称量纸、试管架、棉花、牛皮纸、记号笔、皮筋、纱布、手提式高压蒸汽灭菌锅、电
27、热烘箱、过滤除菌器、培养皿塑料管（带刻度）。四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装1玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2灭菌前玻璃器皿和塑料管的包装培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。塑料管将盖子拧松后，用报纸包好。包装后的培养皿和塑料管须经灭菌之后才能使用。 (二) 培养基的配制 1. 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用
28、最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下: 牛肉膏3 g，蛋白胨l0 g， NaCl 5 g，琼脂13 g, 水1000 mL，pH7.4-7.6。 （1）称量 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底
29、或溢出，最后补足所失的水分。 （3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1 mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用 1 mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度. （4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。供一般使用的培养基此步可省略。 （5）分装 披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入
30、三角瓶内以不超过其容积内一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜灭菌后垂直待凝。 （6）加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法则图1-1。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利透气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的透气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料盖代替棉塞。 （7）包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别
31、、日期。 （8）灭菌 将上述培养基于121.0湿热灭菌20 min。如因特殊情况没能及时灭菌，则应放人冰箱内暂时保存。 （9）摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面长度不超过试管总长的一半。 （10）无菌检查 将灭菌的培养基放入37温箱中培养24-48 h, 无菌生长时可以使用，或放置在冰箱或清洁的橱内，备用。 2高氏1号培养基高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO43H2O 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，琼脂1
32、3 g, 蒸馏水1000 mL，pH 7.4-7.6。（1）称量和溶解 经计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100 mL水中加入1 g的FeSO47H2O，配成浓度为0.01 g/mL的贮备液，再在1000 mL培养基中加入以上贮备液 1mL即可。待所有药品完全溶解后补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （2）pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查
33、同牛肉膏蛋白胨培养基配制。3. 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）的配制 PDA是用于分离真菌的常用培养基。去皮马铃薯200 g；葡萄糖20 g；琼脂13 g；自来水1000 mL。1培养基配制 将马铃薯洗净去皮，称取200 g，切成小块，放入锅中加水1000 mL，煮沸半小时。 用双层洁净纱布过滤去渣，在滤液中加葡萄糖（或蔗糖）20 g，加水补足1000 mL。这样配成的培养液一般呈酸性，用于培养真菌时，不必矫正它的酸度。然后加入琼脂13 g，加热使琼脂完全融化，同时补足应有的水量。趁热分装在试管或三角瓶中，加棉花塞后灭菌。2链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降全4
34、5左右时才能加入。 可先将链霉素配成1的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20)，在1000 mL培养基中加1链霉素0.3 mL，使每毫升培养基中含链霉素30 g。 （三）灭菌1. 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。 （1）加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为宜 （2）装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以免冷凝水沾湿棉塞。 （3）加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开
35、排气阀。 （4）排气 用电炉或煤气加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出. 一般排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内空气已排净(沸后约5min)。 （5）升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。 （6）保压 当锅内压力升到所需压力时，控制热源，计时并维持压力至所需时间。本实验用121，20min灭菌。 （7）降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀，放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 （8）无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24 h，无杂菌生长，即可待用。 2. 干热灭菌法 干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、
36、移液管等的灭菌。 （1）装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放入电热烘箱中。 （2）升温 关好电烘箱门，打开电源开关，旋功恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后，则烘箱绿灯亮，表示巳停止加温。 （3）恒温 当温度升到所需温度后，维持此温度1.5 h。 （4）降温 切断电源，自然降温。 （5）取出灭菌物品 待电烘箱内温度降到70以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。 3. 过滤除菌法 有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因而要采用过滤除菌法。 （1）过滤器的种类 滤膜过滤器：由
37、醋酸纤维素、硝酸纤维素等制成，有孔径大小不同的多种规格(如0.1 m、0.22 m、0.3 m、0.45 m等)，过滤细菌常用0.45 m孔径。其优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，滤速快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。 蔡氏过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大。每张纤维板只能使用1次。 玻璃滤器：是一种由玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器规格很多，5号（孔径2-5 m）和6号（孔径小于2 m）适用于过滤细菌。其优点是吸附量少，但每
38、次使用后要洗净再用。清洗方法是：用水充分冲洗，然后浸于含1KNO3的浓硫酸中24 h，再用蒸馏水抽洗数次。在抽洗液中加入数滴BaCl2扎，至不出现BaSO4沉淀时，即表示巳洗净。 （2）过滤装置 按图2-l进行安装，为阻止空气中细菌进入滤瓶而在接管处塞入棉花、外用纸包好进行121湿热灭菌 20 min。为加快过滤速度, 一般用负压抽气过滤即在自来水龙头上装一抽气装置，利用自来水流造成负压。若接真空泵进行抽滤则速度更快。微量溶液过滤时，可用图2-2的针头式过滤器。五、注意事项1. 称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖：调pH时要小心操作，避免回调。2. 不同培养基各有配制特点，要注意
39、具体操作。 3. 分装过程中注意 不要使培养基在管（瓶）上，以免污染过的棉塞再引起试剂污染。4. 使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，待压力下降到零后，才可打开锅盖。5干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以防包装纸烤焦起火。6过滤除菌时应注意检查过滤装置各连接处是否漏气，以防污染。六、实验报告 1. 记录本实验配制培养基的名称、配方，并简述其配制过程，指明要点。2. 记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温度、压力)。七、问题和思考 1配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么
40、问题?为什么? 2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理? 已灭菌的培养基如何进行无菌检查。 3比较各种灭菌方法的原理及适用范围。4高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭茵后不能骤然快速降落，并要在放净锅内蒸汽才能打开锅盖?实验四 土壤微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、实验目的和内容（一）实验目的1. 学习从土壤中分离微生物的方法。2. 掌握常用的分离纯化微生物的操作技术。 （二）实验内容1用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。 2用平板划线法分离微生物。 3斜面接种及穿刺接种。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的
41、分离与纯化。常用的分离纯化方法有：单细胞挑取法、平板划线法和稀释倒平板法。本实验利用稀释倒平板法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。基本原理为：将含有各种微生物的土壤悬液进行稀释后涂布接种到各种选择培养基平板上，在不同条件下培养，从而使各类微生物在各自的培养基上形成单菌落。单菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，即是一个纯培养。三、实验材料和用具1菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通变形菌(Protues vulgaris)斜面菌种。 2. 培养基巳灭菌的牛肉膏、高氏1号、PDA固体培养基各1瓶。3. 试剂及仪器无菌水(带玻璃珠)、灭过菌的塑料管及枪头、80乳酸、10
42、酚液、95乙醇。 无菌培养皿、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、涂布器。 四、操作步骤（一）土壤稀释分离细菌、放线菌和霉菌 1取土壤 取表层以下5-10 cm处的土样放入灭菌的袋中备用，或放在4冰箱中暂存。 2无菌操作制备土壤稀释液 （1） 制备土壤悬液：称土样1 g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5-10 min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。 图4-1 稀释法分离土壤微生物操作过程(2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5 mL放入4.5 mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液(图2-1)。注
43、意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。3涂布法测定菌落数的方法 （1）倒平板按无菌操作要求，在火焰旁操作(图2-2)，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50)，倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固，备用。 图4-2 倒平板的方法 图4-3 平板涂布菌（2）接种量和培养基 细菌：取10-6、10-7两管稀释液各1 mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接入两个牛肉膏琼脂平板中，涂布均匀。 放线菌：取10-4、10-5两管稀释液，在每管中加入10酚液5-6滴，摇
44、匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出0.2 mL加入相应高氏1号培养基平皿中，涂布均匀。霉菌：取10-2、10-3两管稀释液各0.2 mL，分别接入相应的PDA培养基中（每100 mL加入灭菌的乳酸1 mL），涂布均匀。 （3）培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28-30恒温培养，细菌培养1-2 d，放线菌培养5-7 d，霉菌培养3-5 d可用于观察菌落，用于进一步分离纯化或直接转接斜面。 （二）平板划线分离微生物 1划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，主要方法参见下图。
45、3培养 方法同“土壤稀释分离”。 （三）斜面接种和穿刺接种 1斜面接种 (1) 取新鲜固体斜面培养基分别做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)，然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。 (2) 若接种的菌为细菌，用接种针沾取少量待接菌种然后在新鲜培养基面上之字划线，方向是从下部开始，一直到上部；接种的菌为放线菌或霉菌，用接种针挑取少量菌苔，直接转入新鲜培养基斜面。(3) 接种后30恒温培养，细菌培养48 h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 2穿刺接种 (1) 取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等)，分别接入金黄色葡萄球菌和普
46、通变形菌。 (2) 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然席沿原刺人路线抽出接种针注意接种针不要移动。 (3) 接种后30恒温培养24 h后观察，比较两种菌的生长结果。 五、注意事项 1一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤个分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落达成一片不能计数。 2在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 3放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。 六、实验报告1. 记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。计算方法：选择长出菌落数30-300之间的培养皿进行计数, 按以下公式： 总菌数/g同一稀释度几次重复的菌落平均数稀释倍数 七、问题和思考