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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流遗传育种实验.精品文档.实验一 微生物抗药性突变株的分离LB培养基：（胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 琼脂粉）链霉素灭菌空培养皿 30个实验前一天准备：LB 固体培养基 100ml/三角瓶 6瓶；接种大肠杆菌于5ml液体LB 6支，37震荡培养24h。实验二 紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应四人一组，每班6组菌种：枯草芽孢杆菌培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g；NaCl 5g；水1000ml；pH7.2；琼脂粉)；淀粉培养基（蛋白胨10g；NaCl 5g；牛肉膏5g；可溶性淀粉2g；琼脂；
2、蒸馏水1000ml；pH7.2）无菌生理盐水50ml/瓶 6瓶；10ml离心管20个；带玻璃珠小三角瓶6个；培养皿90个；1.5ml离心管200个；10ml移液管，墙头1ml的3盒试剂：碘液玻璃刮铲实验1 微生物抗药性突变株的分离 【目的要求】学习用梯度平板法分离抗药性突变株的原理和方法。 【基本原理】 抗药性突变株是指野生型菌株基因突变产生的对某些化学药物的抗性变异类型，可在加有相应药物的培养基平板上选出。抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的鉴别手段。在含有一定浓度抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的
3、细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。 为了便于选择适当的药物浓度，本实验用常用的梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板(图2-4.1)：先倒人不含药物的底层培养基，把培养皿斜放，凝固后将平皿平放，再倒入含有链霉素的上层培养基，便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。在平板上涂布经诱变处理的敏感菌，培养后从链霉素浓度较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。 【实验材料】 大肠杆菌Strs；LB液体培养基，LB琼脂培养基；链霉素，70乙醇；无菌吸管，烧杯，试管，玻璃涂棒，水浴锅等。【操作步骤】 1接种大肠杆菌于盛有5 mL LB
4、培养液的试管中，37振荡培养24 h。 2在热水浴中融化LB琼脂培养基。 3倒10 mI。已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中，将培养皿一端垫起使培养基表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固(图2-4.1上)。 4在凝固的平板底部高琼脂一边标上“低”，放平后在底层培养基上加人每毫升含有100 ug链霉素的LB琼脂培养基10 mL。，凝固后制得链霉素浓度从一端的0 ugml。到另一端的100 ugml。的梯度平板 (图2-4.1中)。 5用1 mL。无菌吸管吸取0.2 ml。大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂
5、棒，可在火焰旁或伸进平皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。 6将平板于37培养48 h，结果如图2-4.1下。 7选择12个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。8将平板倒置于37培养48 h。 【实验报告】 1实验结果 图示经一次培养和二次培养的梯度平板上大肠杆菌的生长情况。 2思考题 (1) 梯度平板中部的单个菌落被划线朝高药物浓度方向拉开是为了测试这些菌株的抗性水平。你能设计几种不同的方法来测试这些菌株的抗性水平吗? (2 )是培养基中的链霉素引起了抗性突变吗?请设计一个实验加以说明。(3) 梯度平板法除用于分离抗药性突变株以外，还有什么其他用途? 【注
6、意事项】 1制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。 2严格无菌操作，勿将杂菌误认是抗药性大肠杆菌。实验2 紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应【目的要求】 (1) 了解紫外线的诱变原理； (2) 学习并掌握物理诱变育种的方法； (3) 观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658产生淀粉酶的诱变效应。【基本原理】 一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、射线、高能电子流射线及离子注入等。物理诱变剂(physical mutagen)中，以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变剂则受设备条件的限制，难以普及。紫外线(ultraviolet ray，UV)作为物理诱变剂用于工业微生物菌种的
7、诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。 紫外线的波长在200380 nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA结构变化而造成的。DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。但其最主要
8、的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。 经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活。因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射。注意，经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免在黑暗中突变被修复。【实验材料】(一)菌种 枯草芽孢杆菌BF7658。(二)培养基(见附录三) 肉膏蛋白胨固体培养基，淀粉培养基。(三)试剂和溶液 (见附录四) 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，碘液，无菌生理盐水4.5 mL/管，无菌生理盐水50 mL/瓶。(四)仪器和其他物品20 w紫外灯，磁力搅拌器
9、，离心机；无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管，无菌带玻璃珠的锥形瓶，量筒，烧杯，离心管等。【实验内容】(一) 诱变 1菌悬液的制备取已培养20 h的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL生理盐水将菌苔洗下，并倒人盛有玻璃珠的锥形瓶中。强烈振荡10 min，打碎菌块，将此菌悬液用无菌移液管吸至10 mL离心管中，3000 rmin离心15 min。弃上清液，将菌体用无菌生理盐水10 mL洗涤2次，最后用10 ml，无菌生理盐水制成菌悬液。用无菌移液管移人另一锥形瓶中，调整细胞浓度为108ml。细胞悬液浓度可用平板活菌计数法测定，也可用光密度比浊法测定。2. 平板制作将淀粉琼脂培养基融化后，冷至45
10、左右，每人倒平板9个，凝固后待用。3诱变处理（1）预热 正式照射前开启紫外灯，预热20 min。（2）搅拌 取制备好的菌悬液4 mL移人直径为6 cm的无菌培养皿中。放人无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，在20 w紫外灯下30 cm处进行照射。（3）照射 打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1 min、2 min、3 min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。4稀释涂平板先取未照射的菌悬液0.5 mL加到4.5 mL生理盐水中，稀释至10-6、10-7、10-8作为对照(每条桌子有2人做即可)，然后在红灯下打开紫外灯进行照射1 min、2 min3 min (每组2人，
11、各做一个照射时间)；取照射1 min的菌悬液0.5 mL到4.5 mL生理盐水中，稀释至10-6、10-7、10-8 ；取照射2 min菌悬液0.5 mL，同上方法稀释到10-7，照射3 min菌悬液稀释到10-6；取最后3个稀释度的稀释液各0.1 mL，涂于淀粉培养基平板上；每个稀释度涂2个平板，对照做3个稀释平板。用无菌玻璃刮棒涂匀。用黑布包好照射过的平板，37培养48 h：注意 在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。(二) 计算存活率及致死率 1存活率 (1) 对照样品中活菌数 将培养48 h后对照平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL菌液中的活菌数
12、。 (2) 照射后样品中活菌数 同上，计算照射1、2、3 min后样品1 mL菌液中的活菌数。根据公式计算存活率。 2致死率 同样计算用紫外线处理1、2、3 min后的致死率。（三）观察诱变效应在平板菌落计数后，分别向菌落数在5个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC值)，与对照平板进行比较，根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶诱变的效果，选取HC比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面培养基上培养。此斜面可作复筛用。【实验报告内容】 (1) 将实验结果按表要求如实填人，并分别算出存活率、致死率。存活率 =（处理后1mL菌液中活菌数对照1mL菌
13、液中活菌数） 100致死率 =（对照1mL菌液中活菌数-处理后1mL菌液中活菌数）对照1mL菌液中活菌数 100表1111 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的存活率及致死率 稀释度10-610-710-8存活率致死率对照 0min紫外线 1min紫外线 2min紫外线 3min(2)测量经Uv处理后的枯草芽孢杆菌菌落(各6个)测周围的透明圈直径(mm值)与菌落直径，并计算比值(HC)与对照菌株进行比较。HC=透明圈直径菌落直径表1l一12 透明圈和菌落直径大小及HC比值123透明圈菌落大小HC比值UV 1UV 2UV 3对照 透明圈和菌落大小直径用mm表示。（3） 总结你的实验结果，哪一种照射时间的诱变效果最好？它的存活率、致死率、HC比值各为多少？【思考题】 （1） 紫外线诱变注意事项是什么？（2） 紫外线诱变机理是什么？