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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date保藏法5-微生物菌种常规保藏技术规程国家自然科技资源平台定期移植保藏法适用范围本方法适用于大多数细菌和真菌。原理低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。技术要求不同菌种应根据要求选择合适的培养
2、基。接种时要求无菌操作，避免染菌。保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。方法与步骤培养基制备器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要
3、元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。灭菌根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时
4、，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验。接种斜面接种A.4.2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2 中央划线从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。A.4.2.1.4 密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.5 挖块接种法挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。
5、适用灵芝等担子菌类真菌。穿刺接种用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。保藏保藏温度和时间培养好的菌种于46保存，根据要求每36个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须13个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%70%。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿度计。移植培养将培养物转接到另一新鲜培养基中
6、，再在适宜条件下培养。菌种复壮菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。液体石蜡保藏法适用范围本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如芽孢杆菌属，醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属，曲霉属等)。原理液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。技术要求菌种培养参照附录A。应选用优质化学纯液体石蜡。液体石蜡易燃，在对液体石蜡保藏菌种进行操作时注意防
7、止火灾。保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。方法与步骤液体石蜡将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.1MPa灭菌30分钟取出，置40恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。斜面培养物的制备参照附录A，斜面宜短，不超过试管三分之一为宜。灌注石蜡 无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。保藏将注入石蜡油的菌种斜面直立存放于低温(4-15)干燥处，保藏时间为2-10年不等。恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。沙土管保藏法适用范围本方法
8、适用于产孢类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属以及少数酵母如隐球酵母和红酵母等。不适用于病原性真菌的保藏，特别是不适于以菌丝发育为主的真菌的保藏。原理干燥条件下微生物菌种代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制。此方法可减少菌株突变，延长存活时间。方法与步骤沙土管制备 将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。另取瘦红土100目过筛,水洗至中性，烘干，按沙土= 21混合。把混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1厘米左右。塞好棉塞，0.1MP
9、a灭菌30分钟，或常压间歇灭菌3次，每天每次1小时。灭菌后在不同部位抽出若干管，分别加营养肉汁、麦芽汁、豆芽汁等培养基，经培养检查后无微生物生长方可使用。斜面培养物的制备参照附录A。制备菌悬液向培养好的斜面培养物中注入3mL-5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2mL -0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。干燥用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器内。纯培养检查从做好的沙土管中，按101比例抽查。无菌条件下用接种环取出少量沙土粒，接种于适宜的固体培养基上，培养后观察其生长情况和有无杂菌生长。如出现杂菌或菌落数很少，或根本不长，
10、则须进一步抽样检查。保藏将纯培养检查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低温(4-15)干燥处，半年检查一次活力及杂菌情况。也可将纯培养检查合格的沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。用此方法保藏时间为2-10年不等。复活复活时在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次，也可取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。微生物菌种的冷冻干燥保藏技术规程好氧菌冷冻干燥管的制备4.1.1.1安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，
11、加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌15-20分钟，备用。保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。4.1.1.3冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种纯度检测技术规程（试行），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，
12、只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4.1.1.4预冻一般预冻2小时以上，温度达到-20到-35左右。4.1.1.5冷冻干燥采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断： 安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度
13、接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结 选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。4.1.1.6真空封口及真空检验将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。 熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。4.1.1.7保藏安瓿管应低温避光保藏。4.1.1.8质量检查冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。厌氧菌冷冻干燥管的制备主要程序与需氧菌操作相同安瓿管准备参见4.1.1.1保
14、护剂的选择和准备保护剂使用前应在100的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。冻干样品的准备参见4.1.1.3预冻参见4.1.1.4冷冻干燥参见4.1.1.5真空封口及真空检验参见4.1.1.6保藏参见4.1.1.7质量检查参见4.1.1.8冷冻干燥法适用范围适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。保藏周期不同微生物复苏周期不同，一般10年左右。复苏方法 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安
15、瓿管的顶端， 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。微生物菌种低温冷冻保藏技术液氮超低温保藏技术4.2.1.1安瓿管或冻存管的准备用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121下高压灭菌15-20分钟，备用。4.2.1.2保护剂的准备保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。4.2.1.3微生物保藏物的准备微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在无菌条件下操作。4.2.1.4菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上
16、的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。4.2.1.5预冻预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1为好、使样品冻结到-35。目前常用的有三种控温方法： 程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷
17、却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20至-40冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5。 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。4.2.1.6保藏将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150，液相中温度为-196。保藏周期一般10年以上。4.2.1.7复苏方法从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38-40水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。4.2.1.8适用范围各类微生物。
18、液氮保藏应注意事项 防止冻伤，操作注意安全，带面罩及皮手套 塑料冻存管一定要拧紧螺帽 运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮 注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息 防止安瓿管或塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，要特别小心 注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。-80低温冷冻保藏安瓿管或冻存管的准备参见4.2.1.1保护剂的准备参见4.2.1.2微生物保藏物的准备参见4.2.1.3冻结保藏将安瓿管或塑料冻存管置于-80冰箱中保藏。保藏周期一般1-5年。复苏方法从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38-40水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。适用范围各类微生物。-