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1、,第五章微生物的生产及其影响因素,第一节微生物生长第二节微生物的生长规律第三章环境对微生物生长的影响,第一节微生物生长,微生物生长的概念微生物生长量的测定,一、微生物生长的概念,生长是指微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用大于异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖是指生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。个体生长是指微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长是指群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖,二、
2、微生物生长量的测定,（一）稀释平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。在最适条件下培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50500个菌落数为宜数。,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，
3、其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,（二）血球计数板法,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：简便、直接、快速、准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,（三）称干重将一定量的菌液中的菌体通过离心法或过滤法分离出来，然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%
4、20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。,（四）比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。这种方法的特点是快速、简便；但易受干扰。,第二节微生物的生长规律,细菌的个体生长和同步生长微生物生长曲线微生物的连续培养,一、细菌的个体生长和同步生长,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂
5、的状态，称为同步生长（synchronousgrowth），进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。可能造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。由于诱导法可能造成与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好。在选择法中，有代表性的是Helmstetter-Cummings技术。,Helmstetter-Cummings技术,原理：一些细菌细
6、胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,A-适应期，B-对数增长期，C-稳定期，D-衰亡期,二、微生物生长曲线,该生长曲线只适用于单细胞微生物，包括细菌和酵母菌。,微生物的典型生长曲线,适应期的特点：,生长繁殖的速度几乎等于零细胞形态增大，杆菌的长度增加。细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶对外界不良环境条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物敏感。原因：适应新的环境
7、条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。,菌种的菌龄：如果以对数期的“种子”接种，则子代培养的适应期就短。接种量：一般来说，接种量大，适应期就短，反之则长。因此在发酵工业上，为缩短适应期，一般采用1/10的接种量。培养基成分：接种到营养丰富的天然培养基中的微生物要比接种到营养单调的合成培养基中的适应期短。新接种的培养基与菌种的原培养基越接近，适应期就越短。发酵工业上需尽量缩短该期，以降低生产成本。在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,影响适应期长短的因素：,生长繁殖的速度很快，活菌的数目呈对数增长，因而细胞每分裂一次所需的代时(世代时间)或原生质增加1倍所需的时间最短。细胞进行平衡生长，菌体内
8、各种成分最均匀。酶系活跃，代谢旺盛。在此时期内，菌细胞的形态特征均匀一致，最代表种的特征。此时期内的微生物的生化特性均匀一致，并且典型。,指数期的特点：,影响指数期微生物增代时间的因素：,菌种：不同菌种的代时差别极大。营养成分：同一种细菌在营养物丰富的培养基中生长，其代时较短，反之则长。营养物的浓度：在营养物浓度很低的情况下，营养物的浓度才能影响生长速率，随着营养物浓度的增高，生长速率不受影响，而只影响最终的菌体产量。如果进一步提高营养物浓度，则生长速率和菌体产量均不受影响。培养温度：温度对微生物的生长速率有极其明显的影响。发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度。食品工业上尽量使有害微生
9、物不能进入此期,特点：1.生长速率常数R等于0。2.菌体产量达到了最高值。3.合成次生代谢产物。4.细胞内出现储藏物质，芽孢杆菌内开始产生芽孢。产生原因：1.营养物尤其是生长限制因子的耗尽。2.营养物的比例失调，如碳氮比不合适。3.有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）。4.物化条件（pH、氧化还原势等）不合适。,稳定期,微生物生长与代谢产物形成的关系,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁
10、殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。,衰亡期,特点：1.生长速率常数R为负值。2.细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形。3.释放次生代谢产物，芽孢等。4.菌体开始自溶。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。,三、微生物的连续培养,概念连续培养(continuousculture)又称开放培养(openculture)是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜
11、的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,连续培养原理:,连续培养器,按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器多级连续培养器,一般连续培养器固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐,连续培养器,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培
12、养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊连续培养,恒浊器培养系统,恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度(如碳、氮源、生长因子等)，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最
13、高菌体产量。应用范围：实验室科学研究,恒化器培养系统,恒浊器与恒化器的比较,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言有许多优点：高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作。自控：便于利用各种仪表进行自动控制。产品质量稳定。节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月1年。,第三节环境因素对微生物生长的影响,温度水分氧气pH渗透压氧化还原电位化学药物,每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能
14、生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为嗜低温微生物、嗜中温微生物、嗜高温微生物这三个类型。,一、温度,几种微生物的生长温度三基点,二、水分,水分活性值(Aw值)：是指在密闭容器内含有水溶性物质的蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压的比值。以纯水的蒸汽压为P0，水溶性物质的蒸汽压为P，则Aw=P/P0。不含任何固形物成分的纯水的PP0，即Aw=1；绝对不含水分的物品的P=0，即Aw=0，因此Aw值最大为1，最小为0。所以Aw值在0与1之间。,各种微生物生长的最低Aw值,根据不同微生物对氧的要求，可将它们分为：1需氧微生物
15、(aerobe)绝大多数丝状真菌、放线菌和部分细菌属于这个类型。2厌氧微生物(anaerobe)主要是一些细菌属于这一类群，如梭状芽孢杆菌属、产甲烷杆菌属等。3兼性需氧微生物(facultativeaerobe)绝大多数酵母菌和部分细菌属于这种类型。4微量需氧微生物(microaerophilic)只有少数细菌属于此类型，如拟杆菌属中的个别种。5耐氧性厌氧微生物(aerotolerantanaerobe)主要是一些乳酸菌属于该呼吸类型。,三、氧气,四、pH值,根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌。耐碱微生物：许多链霉菌。中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌。嗜酸微生物：硫杆菌属。耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌。各类微生物生长的最适pH值：细菌为7.07.6，放线菌为7.58.5，霉菌为4.05.8，酵母菌为3.86.0。,五、渗透压,根据微生物对高渗透压耐性的不同，将其分为以下三类：高度嗜盐细菌(2030%食盐溶液中生长)嗜盐细菌中等嗜盐细菌(518%的食盐溶液中生长)低等嗜盐细菌(25%的食盐溶液中生长)耐盐细菌（可在10%以下的食盐溶液中生长）耐糖细菌（可在60%以下的含糖高渗溶液中生长）普通微生物一般在0.850.90的食盐溶液中生长。,