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1、复件微生物检测复件微生物检测-第第5章章2一、生物学特性一、生物学特性1 1. .形态形态 两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，（0.4-0.90.4-0.9） m m (1-3)m(1-3)m，无芽无芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少孢，周生鞭毛，一般无荚膜，少数有包膜。数有包膜。 光滑型的细菌大小均匀，粗光滑型的细菌大小均匀，粗糙型则大小不一，长短不一。糙型则大小不一，长短不一。（2 2）抗原变异）抗原变异nSmooth-Transient-RoughSmooth-Transient-Rough变异：为避免变异：为避免R R型的出现，型的出现，保存培养基内不应含有糖类，不要多次
2、移种传代。保存培养基内不应含有糖类，不要多次移种传代。nV-WV-W（Vi-OVi-O）变异：具有变异：具有ViVi抗原的菌株称为抗原的菌株称为V V型菌，型菌，失去失去ViVi抗原的菌株称为抗原的菌株称为W W型菌。型菌。W W型菌只能同其相应型菌只能同其相应的的O O型血清发生凝集，而不与型血清发生凝集，而不与ViVi血清凝集。血清凝集。nHO-OHO-O变异：有鞭毛抗原的变异：有鞭毛抗原的HOHO型菌变为无鞭毛的型菌变为无鞭毛的O O型菌。型菌。n位相变异：有双相鞭毛抗原的沙门菌两个相可以互位相变异：有双相鞭毛抗原的沙门菌两个相可以互变。通常在一个培养物内二相并存，在平板上各占变。通常在
3、一个培养物内二相并存，在平板上各占半数，但挑取单菌落，经多次移接后，又出现两相半数，但挑取单菌落，经多次移接后，又出现两相各半现象，这种由一相变为另一相的变异，称为位各半现象，这种由一相变为另一相的变异，称为位相变异，单相菌不产生位相变异。相变异，单相菌不产生位相变异。5、 发病机理和症状发病机理和症状n菌量大菌量大n活菌和菌体内毒素协同作用活菌和菌体内毒素协同作用n小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜小肠和结肠里繁殖，侵入粘膜 ，由淋巴，由淋巴系统进入血液系统进入血液n潜伏期潜伏期8-48hn急性期，每克粪便中沙门菌多至急性期，每克粪便中沙门菌多至10亿个亿个食物中毒的特征性症状食物中毒的特征性症状n
4、腹泻腹泻n恶心恶心n腹痛腹痛n低烧低烧和寒颤寒颤n有时呕吐呕吐、头痛头痛、倦怠倦怠伤寒的典型症状伤寒的典型症状n持续发发热热39-40n昏睡昏睡症n剧烈腹痛腹痛（腹部痉挛痉挛）n头痛头痛n食欲不振n出现扁平的玫瑰红色点状红疹红疹（一）（一） 检验程序检验程序供试品供试品供试液供试液预增菌预增菌增菌增菌DHLS.SEMBEMBMaCCMaCCTSI（三糖铁琼脂）三糖铁琼脂）氰化钾氰化钾赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验尿素酶试验尿素酶试验吲哚试验吲哚试验血清学试验血清学试验半固体营养琼脂半固体营养琼脂革兰染色、镜检革兰染色、镜检报报告告二、沙门菌常规检查法二、沙门菌常规检查法1.1.预增菌预增菌:
5、 :u将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，将供试液接种在无选择性增菌培养基中培养，使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌使受损伤的细菌得以修复，然后再转接至增菌培养基中。培养基中。u一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用一般在营养肉汤中。但美、英、日、欧均选用乳糖肉汤作预增菌液。以乳糖肉汤作预增菌液。以1 1：1010的比例接种，的比例接种，18-2418-24h,35-37h,35-37。预增菌培养基的选择预增菌培养基的选择培养基培养基商品商品缓冲蛋白胨水（缓冲蛋白胨水（BPW）使用于所有商品使用于所有商品BPW+酪蛋白酪蛋白巧克力巧克力乳糖肉汤乳糖肉汤蛋和蛋制品，火腿，蛋和蛋制品，
6、火腿，pH6的着的着色食品色食品乳糖肉汤乳糖肉汤+表面活性剂表面活性剂7或曲拉通或曲拉通X-100椰肉，肉，干燥或加工过的动椰肉，肉，干燥或加工过的动物食品物食品乳糖肉汤乳糖肉汤+ 0.5%凝胶酶凝胶酶凝胶凝胶脱脂乳脱脂乳+亮绿亮绿巧克力，糖，糖衣巧克力，糖，糖衣胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤香料、香草、干酵母香料、香草、干酵母胰蛋白胨大豆肉汤胰蛋白胨大豆肉汤+ 0.5%硫酸钾硫酸钾洋葱和蒜粉等洋葱和蒜粉等水水+亮绿亮绿奶粉奶粉2.选择性增菌选择性增菌n取取1 1mLmL预增菌液转种至增菌培养基预增菌液转种至增菌培养基1010mLmL。37372424h h，培养基可采用亚硒酸盐胱氨酸培养基
7、可采用亚硒酸盐胱氨酸肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养肉汤培养基或四硫磺酸盐煌绿肉汤培养基，我国与英国相同采用后者。美、日基，我国与英国相同采用后者。美、日采用二者联用有助于提高沙门菌的检出采用二者联用有助于提高沙门菌的检出率。率。转接到选择性转接到选择性培养基培养基免疫免疫 磁性分离技术磁性分离技术（Immunomagnetic separation，IMS）3.分离培养分离培养选择性培养基：选择性培养基：nDHLDHL：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色nHEHE：蓝绿或蓝色，产硫化氢
8、的菌落中心黑色蓝绿或蓝色，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株黄色、中心黑色nSSSS：无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色无色半透明，产硫化氢的菌落中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色或全黑，乳糖阳性菌株粉红色、中心黑色n分离沙门菌应以出现分离沙门菌应以出现单个菌落单个菌落为准，否则应重为准，否则应重新分离。新分离。n由于平板用前未烘干，或因分离不良菌落连片由于平板用前未烘干，或因分离不良菌落连片均须重新分离。均须重新分离。n致病菌菌落一般在经致病菌菌落一般在经36243624h h培养后，再放置培养后，再放置室温室温2-32-3天后不发生变化，
9、而非致病菌则继续天后不发生变化，而非致病菌则继续增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。增生、增厚，并带黄灰色，并产生臭味。n对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍对可疑菌落可放置室温观察几天，再决定取舍(1)(1)初步鉴别试验：初步鉴别试验：三糖铁琼脂三糖铁琼脂 |乳糖乳糖:蔗糖蔗糖:葡萄糖葡萄糖=10 : 10 : 1|以酚红作指示剂以酚红作指示剂|当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色；当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养基均呈黄色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而释如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于细菌生长分解蛋白胨而释放氨，酚红显碱性红
10、色、而底层黄色放氨，酚红显碱性红色、而底层黄色|细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁铵产生不溶性黑色硫化亚铁。亚铁。4.生化试验生化试验斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面红色、底层黄色，无黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色 除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌等也可除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌
11、、志贺菌等也可出现上述反应。出现上述反应。n 吲哚试验：阴性吲哚试验：阴性n志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生生H H2 2S S。n大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H H2 2S S 。n沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生H H2 2S S ，多数产气。多数产气。n下面照片所示下面照片所示2-3-42-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？，可能是大肠杆菌、
12、沙门氏菌还是志贺氏菌？赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验纯培养菌落纯培养菌落赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶 产酸产酸含糖蛋白胨培养基含糖蛋白胨培养基溴甲酚紫溴甲酚紫产碱产碱(尸胺尸胺) CO2对照为黄色,阳性为紫色培养时间不超过四天伤寒和鸡沙门菌除外，均为阳性含糖蛋白胨培养基含糖蛋白胨培养基紫色紫色(3)尿素酶试验尿素酶试验n区别变形杆菌区别变形杆菌n具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生氨，培养基碱性，使酚红变素，产生氨，培养基碱性，使酚红变红。沙门菌反应红。沙门菌反应阴性阴性 注意注意：用无尿素的培养基作对照：用无尿素的培养基作对照 (4)氰化钾试验氰化钾试验n沙
13、门菌、志贺菌和埃希菌的沙门菌、志贺菌和埃希菌的生长受生长受KCN抑制。抑制。nKCN 浓度为浓度为1：13300或或1：10000。n沙门菌此反应沙门菌此反应阴性阴性。待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物KCN培养基培养基3648h不生长不生长铁卟啉铁卟啉呼吸酶失活呼吸酶失活注意注意：u氰化钾的浓度氰化钾的浓度u控制接种量控制接种量u试管封口严密试管封口严密u操作谨慎操作谨慎u用后的培养管加硫酸亚铁和氢用后的培养管加硫酸亚铁和氢氧化钾去毒氧化钾去毒u对照不加对照不加 KCN（5）动力检查）动力检查l沙门菌周生鞭毛，能运动。沙门菌周生鞭毛，能运动。l猪霍乱沙门氏菌（猪霍乱沙门氏菌（S.gallina
14、rumS.gallinarum）和鸡白痢沙门氏）和鸡白痢沙门氏菌（菌（ S.pullorumS.pullorum）没有运动性）没有运动性5.血清学凝集试验血清学凝集试验（1 1）沙门菌属诊断血清）沙门菌属诊断血清诊断血清规格：诊断血清规格：1010种种1 1套套：主要供伤寒、副伤寒沙门菌初步：主要供伤寒、副伤寒沙门菌初步诊断用。包括诊断用。包括ViVi及及A-FA-F群多价血清各群多价血清各1 1种；种；O O因子血清因子血清4 4种；种；H H 因子血清因子血清4 4种种2626种种1 1套套：主要供沙门菌常见菌型定群和初：主要供沙门菌常见菌型定群和初步定型用。包括步定型用。包括ViVi及及
15、A-FA-F群多价血清各群多价血清各1 1种；种；O O因子血清因子血清9 9种；种；H H 因子血清因子血清1515种种5757种种1 1套套：主要供沙门菌常见菌型定型用。：主要供沙门菌常见菌型定型用。包括包括ViVi及及A-FA-F群多价血清各群多价血清各1 1种；种；O O因子血因子血清清1616种；种； O O复合因子血清各复合因子血清各1 1种；种；H H 因子因子血清血清3131种；种； H H复合因子血清复合因子血清3 3种种144144种全套种全套：供各型沙门菌诊断用。包括诊供各型沙门菌诊断用。包括诊断各型沙门菌用的各种多价断各型沙门菌用的各种多价O O、多价多价H H血血清和
16、单因子及复合因子血清清和单因子及复合因子血清 群别群别菌种名称菌种名称O抗原成分抗原成分A甲型副伤寒杜雷佐变种甲型副伤寒杜雷佐变种(S. para Typhi A)2,12B里丁沙门菌里丁沙门菌(S. reading)4,12C1猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌1350(S. cholerae-suis)6,7C2新港新港(纽波特纽波特)沙门菌沙门菌(S. newport)6,8D1伤寒沙门菌伤寒沙门菌0901(S. typhi)9,12E伦敦沙门菌伦敦沙门菌(S. London)3,10F阿伯丁沙门菌阿伯丁沙门菌 (S. aberdeen)11A-F群O多价血清的代表菌株n根据沙门菌菌型调查结果，根
17、据沙门菌菌型调查结果，95%95%以上的沙门菌都属于以上的沙门菌都属于A-FA-F六六个个O O群，群，常见菌型不过常见菌型不过2020个左右，因此沙门菌检验，主要是个左右，因此沙门菌检验，主要是对对A-FA-F群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用A-FA-F群多价群多价O O血清。血清。凝集试验方法凝集试验方法n二者比例适当，菌量过多过二者比例适当，菌量过多过少均不易观察到正确结果。少均不易观察到正确结果。n 阳性反应通常在阳性反应通常在3 3minmin内发生。内发生。n血清效价低反应迟缓时，应血清效价低反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，放一个将玻片置培养
18、皿内，放一个湿棉球，盖上皿盖，经约湿棉球，盖上皿盖，经约2020minmin再观察结果。再观察结果。n出现凝集现象的待检菌培养出现凝集现象的待检菌培养物，应以灭菌的生理盐水溶物，应以灭菌的生理盐水溶液代替液代替A-FA-F多价多价O O血清，与培血清，与培养物混匀做对照试验，对照养物混匀做对照试验，对照应无凝集现象，方可判为阳应无凝集现象，方可判为阳性反应。性反应。A-F多价多价O血清血清稀释稀释接种环沾取接种环沾取2-3环环1.5cm0.5cm条形涂抹条形涂抹待检菌待检菌36 18-24h接种环刮取少许接种环刮取少许混匀 待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称待检菌在生理盐水溶液中产生凝集，称自
19、家凝集现象，这种现象多为自家凝集现象，这种现象多为S-RS-R所致。所致。 当当A-FA-F多价多价O O血清凝集试验为阴性时，还血清凝集试验为阴性时，还应当考虑是否因为待检菌含有应当考虑是否因为待检菌含有ViVi抗原所致。抗原所致。3、结果判断及报告、结果判断及报告（1）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价多价O血清凝集试验阳性反应，做出供试品检出沙门菌血清凝集试验阳性反应，做出供试品检出沙门菌报告。报告。（2）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属）生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多多价价O血清凝集试验阴性反应，做出供试品未检出沙血清凝集
20、试验阴性反应，做出供试品未检出沙门菌报告。门菌报告。（3）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属）生化试验符合沙门菌属反应，沙门菌属A-F多价多价O血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门血清凝集试验阴性反应；或生化试验不符合沙门菌属反应，沙门菌属菌属反应，沙门菌属A-F多价多价O血清凝集试验阳性血清凝集试验阳性反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。反应；均应进一步鉴定后再做结论报告。n对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待对于疑似菌株或须进一步鉴定的菌株，根据待检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生检菌已测试的特性，可选择增添一些必要的生化试验。化试验。糖醇发酵试验糖醇发酵试验明胶液化试验明
21、胶液化试验硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验甲基红试验甲基红试验VPVP试验试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验丙二酸钠试验丙二酸钠试验有机酸盐利用试验有机酸盐利用试验甘油品红试验甘油品红试验明胶液化试验明胶液化试验被胶原酶分解被胶原酶分解判断结果前，冰箱冷却。判断结果前，冰箱冷却。明胶的用量与质量明胶的用量与质量肠杆菌科一般为阴性反应肠杆菌科一般为阴性反应假单胞菌一般为阳性假单胞菌一般为阳性硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验待检菌硝酸盐琼脂斜面30s培养物培养物-萘胺1mL对氨基苯磺酸1mL阳性3618-24h阴性亚硝酸盐存在u硝酸盐没有被
22、还原（真阴性反应）硝酸盐没有被还原（真阴性反应）u假阴性结果假阴性结果:硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物，硝酸盐还原成非亚硝酸盐的其他产物，如如NH3、N2、NO或或N2O和和羟胺。羟胺。u需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。u肠杆菌科细菌皆为阳性反应肠杆菌科细菌皆为阳性反应苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物10%三氯化铁三氯化铁4-5滴滴苯丙氨酸琼脂培养
23、基苯丙氨酸琼脂培养基3618-24h苯丙酮酸苯丙酮酸阳性苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸脱氨酶接种培养物要多避免假阴性立即观察，5min之内变形杆菌阳性，肠杆菌科阴性半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物制成浓菌液制成浓菌液36 5min振摇使酶释放振摇使酶释放阳性生理盐水生理盐水甲苯甲苯1 1滴滴ONPG0.25mlONPG0.25ml37 20min、3h、18h、24huONPG=ONPG=邻硝基酚邻硝基酚-D-D半乳糖苷半乳糖苷u阴性反应不变色阴性反应不变色uONPGONPG为无色为无色upH7.0pH7.0，过酸假阴性，过碱假阳过酸假阴性，过碱假阳性性甘油品红试验甘油品红
24、试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物甘油品红肉汤培养基甘油品红肉汤培养基368d丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛紫红色醌式化合物紫红色醌式化合物品红品红u未接种培养基做对照未接种培养基做对照u复红复红=品红品红u培养时间长培养时间长u用于沙门菌属种间鉴别用于沙门菌属种间鉴别常见沙门菌阴性，乙型副常见沙门菌阴性，乙型副伤寒结果不定伤寒结果不定有机酸盐利用试验有机酸盐利用试验待检菌新鲜营养肉汤培养物待检菌新鲜营养肉汤培养物有机酸盐培养基有机酸盐培养基3614d酸酸沉淀沉淀蓝色蓝色每天观察每天观察酒石酸柠檬酸钠黏液酸溴香草酚兰黄绿色黄绿色白色白色 0.5 0.5mlml醋酸铅饱和水溶液醋酸铅饱和水溶液 u阴性反
25、应一直为蓝色并有大量沉淀u沙门菌对右旋洒石酸盐多为阳性，志贺菌为阴性，培养时间长；沙门菌对左旋洒石酸盐反应不同，其他属为阴性u培养时间长u迟缓反应可分别确定发生期u培养基调中性丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验待检菌新鲜培养物待检菌新鲜培养物丙二酸钠培养基丙二酸钠培养基3648h碳酸钠碳酸钠绿色绿色溴香草酚兰蓝色蓝色u先溶酵母膏和盐，调先溶酵母膏和盐，调6.8后，后，再加指示剂再加指示剂u丙二酸钠为唯一碳源丙二酸钠为唯一碳源u黄色为产酸，阴性黄色为产酸，阴性u任何蓝色均判为阳性任何蓝色均判为阳性4、注意事项、注意事项n培养基培养基n对照对照n挑取菌落挑取菌落n纯培养纯培养n严格按照规定进行严格按
26、照规定进行n避免对环境造成污染避免对环境造成污染三、沙门菌噬菌体检验法三、沙门菌噬菌体检验法注意事项：n平板涂菌前一定要干燥，以琼脂表面稍平板涂菌前一定要干燥，以琼脂表面稍有皱纹为宜，吸水性好。有皱纹为宜，吸水性好。n试验菌液的浓度以肉眼观察，不呈现明试验菌液的浓度以肉眼观察，不呈现明显混浊为宜，不可过浓。显混浊为宜，不可过浓。n使用棉签涂布菌液时，勿将琼脂表面划使用棉签涂布菌液时，勿将琼脂表面划破，影响结果。破，影响结果。四四 荧光抗体法荧光抗体法增菌液涂片增菌液涂片加荧光抗体加荧光抗体3730min 95%乙醇浸洗乙醇浸洗1-2minPBSpH9.0冲洗冲洗K氏固定液固定氏固定液固定5-1
27、05-10minminPBSpH9.0浸洗浸洗10min蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗PBSpH9.0缓冲甘油封片缓冲甘油封片镜检镜检n专门检测沙门氏菌包括伤寒专门检测沙门氏菌包括伤寒, 副伤寒沙门氏菌跟其他副伤寒沙门氏菌跟其他乳糖乳糖 (+) 的菌种的菌种 n更清楚的区分：沙门氏菌落粉红色到洋红色；其他更清楚的区分：沙门氏菌落粉红色到洋红色；其他细菌透明或淡蓝细菌透明或淡蓝 n容易阅读：透明的背景，容易阅读：透明的背景，18-24h培养后有较大的菌培养后有较大的菌落落 四 其它方法nELISAnDNA探针nPCR技术检样检样25g+增菌液增菌液挑取可疑菌落挑取可疑菌落3-5个个EMB或或MaccTSI、动力动力TSI底层底层+、斜面、斜面-、H2S-、不产气、无动力不产气、无动力血清学分型血清学分型进一步生化试验进一步生化试验非左非左非志贺菌非志贺菌生化分群生化分群葡萄糖胺试验、葡萄糖胺试验、 柠檬酸盐、柠檬酸盐、 LYS-、尿素、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷、水杨苷、七叶苷志贺菌分群分型结果志贺菌分群分型结果非志贺菌非志贺菌HE或或SS阳性结果阳性结果志贺氏菌检验程序志贺氏菌检验程序52 结束语结束语