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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date超声波法提取山楂叶中总黄酮条件研究论文超声波法提取山楂叶中总黄酮条件研究论文 本科生毕业设计（论文）题 目：超声波法提取山楂叶中总黄酮的条件研究学生姓名： 李友鹏 刘浩 刘高鹏 学 号： 院 系： 化学工程学院 专业年级： 2011级应用化学3班 指导教师： 2015年6月12日-摘 要总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分
2、。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中分离出的最多的功效组分是黄酮类物质。利用超声波法，以芦丁为参照品，硝酸铝作显色剂，在510nm波长以分光光度法测定总黄酮含量。结果测得工作曲线的回归方程为A=0.0091C+0.0023，r=0.9980，a=0.0023，b=0.0091。线性相关系数R=0.9980。采用单因素考察法对不同提取溶媒、乙醇浓度、温度、时间、料液比进行总黄酮含量的测定，得出较佳的实验条件为：乙醇的体积分数为70%，料液比1:20、超声温度50，超声时间60min，此时得到的黄酮质量为137.555mg。通过四因素三水平的正交实验，得出影响总黄酮提取率的主要因素为乙醇浓度超声温度
3、料液比超声时间。关键词：山楂叶；黄酮类化合物；超声波法；分光光度法ABSTRACTRefers to the total flavones, it is a kinds of natural products, widely exist in the plant kingdom, is many effective components of Chinese herbal medicine.Hawthorn complex chemical composition, isolated from hawthorn leaves most of the efficacy ingredient is
4、 flavonoids.This experiment using ultrasonic method，use Rutin as reference，Aluminum nitrate as chromogenic agent。The total content of flavonoids by spectrophotometry at the 510 wavelength.The results measured the regression equation of working curve for A=0.0091C+0.0023，r=0.9980，a=0.0023，b=0.0091。Th
5、e linear correlation coefficient R=0.9980.By the method of single factor investigation, different extraction solvent, ethanol concentration, temperature, time, and solid-liquid ratio to determine the content of total flavonoids.Then get the better experimental conditions for:The volume fraction of e
6、thanol 70%,The material-water ratio1:20, Ultrasonic temperature 50,Ultrasonic time 60min, At this time of flavonoids content is 137.555mg.Through the four factors three levels orthogonal experiment get that the main factors influencing the flavonoids extraction rate is ethanol concentration ultrason
7、ic temperature solid-liquid ratio ultrasonic time.Keywords：Hawthorn leaves; Flavonoids; Ultrasonic method; Spectrophotometry目 录第一章 绪论11.1 研究背景11.1.1 山楂叶的简介11.1.2 山楂叶中黄酮类化合物11.1.3 黄酮类化合物的研究现状31.2 山楂叶中总黄酮的提取方法41.2.1 水提法41.2.2 浸渍法41.2.3 微波提取法51.2.4 酶解法51.2.5 超临界流体萃取技术51.2.6 超声波法51.3 山楂叶中黄酮的测定方法61.3.1 分
8、光光度法61.3.2 色谱法61.3.3 纸色谱法71.3.4 毛细管电泳法71.4 总黄酮类化合物应用前景71.4.1 抗心血管病药物71.4.2. 抗肝脏毒药物81.4.3 止咳平喘药81.4.4 天然抗氧化剂81.4.5 无公害农药81.4.6 在食品行业中的应用81.5 课题研究的目的、主要内容及其意义91.5.1 课题研究的目的91.5.2 课题研究的主要内容91.5.3 课题研究的意义9第二章 实验部分112.1 实验原理112.2 实验仪器与试剂112.2.1 实验仪器112.2.2 实验试剂122.2.3 试剂的制备122.3 分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量122.3.1
9、芦丁对照品溶液的制备30122.3.2 标准曲线的绘制122.3.3 山楂叶中黄酮含量的测定132.4 超声波提取工艺研究132.4.1 提取溶媒的选择132.4.2 超声波提取单因素试验142.4.3 正交试验142.5 精密度实验152.6 稳定性试验152.7 重复性实验15第三章 实验结果与讨论173.1 山楂叶中总黄酮含量的测定173.1.1 合适波长的选择173.1.2 芦丁标准曲线的绘制183.2 超声波提取工艺研究183.2.1 提取溶媒的选择试验结果与讨论183.3 超声波提取单因素实验193.3.1乙醇浓度对黄酮提取率的影响193.3.2 料液比对总黄酮提取率的影响203.
10、3.3 提取时间对黄酮提取率的影响213.3.4 提取温度对总黄酮提取率的影响223.4 超声波提取正交实验233.5 芦丁对照品精密度校准试验结果与讨论243.6 稳定性试验结果与讨论253.7 重复性试验结果与讨论26第四章 结 论27参考文献28致 谢31附录A：开题报告32附录B：文献综述38第一章 绪论1.1 研究背景1.1.1 山楂叶的简介山楂叶，中药名。为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶。夏、秋二季采收，晾干。分布于东北、华北等地。山楂是起源于我国的特产果树，有3000多年的栽培历史1。山楂叶为山楂的干燥叶，含有多种化学成份，主要有黄酮和三萜两大类2。国内自20世纪50年代，就开始
11、了对山楂叶的研究，随着中药提取和分析技术的现代化，山楂叶提取物的研究取得了很大的进展，其制剂益心酮片、胶囊、滴丸等已广泛应用于临床。药理及临床试验表明：山楂叶中黄酮类化合物具有降血压、调血脂、增加冠脉流量、改善心肌供血供氧等作用，对高血压、高血脂、冠心病及心绞痛等心血管疾病均具有显著疗效3。此外，山楂叶黄酮还具有抗氧化4、抑制肿瘤细胞增殖的作用5。山楂叶最佳采收期应为6月中旬至8月初，在山楂叶黄酮含量的高峰期采集山楂叶，可充分利用资源，保证其收率和质量，提高利用价值。1.1.2 山楂叶中黄酮类化合物黄酮类化合物泛指两个苯环(A-环和B-环)，通过中央三碳链相互链接，从而行成的系列C6-C3-C
12、6化合物。主要指以2-苯基色原酮为母核的化合物,其基本结构为：2-苯基色原酮。山楂叶的化学成份复杂，从山楂叶中分离出的最多的功效组分是黄酮类物质，黄酮类化合物是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，普遍存在于植物界中。山楂叶中的黄酮类化合物主要包括以下三大类：黄酮类、黄酮醇类和双氧黄酮类。山楂叶中黄酮类化合物的种类较多，其基本骨架是2-苯基色原酮(见图1-1)，不同之处是3号碳原子及苯环上取代基的种类和位置不同以及一吡酮环发生变化。山楂叶的抗氧化活性强弱与这些因素有关，只有分子结构满足一定条件时才能表现出较强的作用，其中最主要的是羟基化程度和羟基的位置，且一般认为环中的邻二羰基起
13、着主要作用，分子中酚羟基的数目或位置不同，彼此间的极性也不同，利用这一特性可以选择适当极性的溶剂系统来提取抗氧化活性较高的成分。图1-1 2-苯基色原酮(1) 消除自由基和抗氧化活性自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸相结合，转变成氧化物或过氧化物，使之丧失活性或变性，细胞功能发生障碍，引起机体逐渐衰老或病变。生物体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷氧自由基等。王毕妮等6的研究表明黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。研究显示：黄酮类化合物具有抑制自由基的生成、降低脂质过氧化7和刺
14、激抗氧化酶的作用，其作用机理在于它能有效阻止自由基在体内产生的三个阶段8，即与超氧阴离子自由基反应阻止自由基引发；与金属离子螯合阻止OH的生成；与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。(2) 对酒精中毒的解毒作用和治疗酒依赖的作用酒的主要成分乙醇在代谢过程中产生大量乙醛，具有较强的毒性。进入人体内的乙醇大部分在十二指肠和空肠吸收，在体内代谢过程中产生过量的自由基，对生物膜造成严重的损伤，现代医学研究表明，酒精中毒可以引起NADH/NAD比值增高，造成肝脏纤维化或坏死，凋亡小体出现，乙醇脱氢酶改变等。大豆异黄酮对急性酒精中毒小鼠实验表明具有较好的解毒和抗氧化保护作用，能够拮抗乙醇对中枢神经的抑制作
15、用，延长小鼠耐受酒精的时间；促进乙醇分解，降低血液乙醇浓度，加速乙醇的排泄；清除代谢过程中过量的自由基，保护肝细胞免受自由基亲电子化合物和毒物的损害9。(3) 防癌抗癌作用Hussein等先后预测和发现了黄酮类化合物具有防癌抗癌作用。黄酮类化合物主要通过三种途径来达到防癌、抗癌的作用。即抗自由基作用、直接抑制癌细胞生长和抗致癌因子等10。物理化学等致癌因子导致自由基在体内富集，引起脂质过氧化，破坏细胞的DNA从而引发癌症。黄酮类化合物是自由基猝灭剂和抗氧化剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到防癌、抗癌的作用11。(4) 抗肿瘤作用黄酮类化合物的抗菌和抗病毒作用已得到医学界的肯定，其抗
16、肿瘤作用主要是通过诱导细胞凋亡、促进抗肿瘤细胞增殖、干预细胞信号转导和促进抑癌基因表达等途径来实现12。尽管黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性时，均有A环与受体的负电荷中心结合、C环与受体的正电荷中心结合、其它部分通过氢键与受体发生作用的共性13，但因其苯环上取代基的不同而具有不同的抗肿瘤活性。如以不同糖基取代时，其抗肿瘤、抗氧化作用效果的差别就会很大。(5) 抗心血管疾病黄酮类化合物具有抗心血管疾病的功能美国食品与药物管理局(FDA)于1999年10月就已将大豆异黄酮中的大豆蛋白推荐为降低血液中胆固醇浓度，以减少患心血管疾病危险的健康食品14。研究表明，黄酮类化合物可治疗心脑血管系统的一些疾病，有降
17、血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用。可用于治疗高血压、动脉硬化。(6) 抗骨质疏松 黄酮类化合物可以用于治疗骨病和骨质疏松等症。其作用机理在于15：其一，它既可以抑制前列腺素E2(PGE2)的胶原蛋白合成增加，又能抑制PGE2的胶原蛋白合成减少，通过调节使其含量趋于平衡。因此可以用于治疗骨病；其次，它能提高甲状腺对雌激素的敏感性，使甲状腺C细胞分泌降钙素的作用加强，最终抑制骨再吸收而治疗骨质疏松症；其三，它还能抑制饮食中缺钙和维生素D引起的骨密度和骨钙含量的降低16。1.1.3 黄酮类化合物的研究现状 祖国大陆山楂叶的应用研究始于20世纪，70年代至80年代中期进入了比较系
18、统的基础性研究。从90年代初至今在山楂叶应用方面取得了长足的进展。研究表明山楂叶中的活性物质主要为黄酮类化合物。王秉极17等采用硅胶柱色谱分离和旋转色谱分离，从北京山楂叶中分离一系列成分并进行了鉴定，分别是5,7-二羟基黄酮(柯因)、3,5,7-羟基黄酮、5,7-二羟基-2-甲氧基黄酮、二十三烷酸甲酯、邻苯二甲酸(2-乙基苯基)酯和癸二酸(2-乙基苯基)酯。迟家平等对辽宁西部产山楂叶进行了全面的研究，其中用加压硅胶柱层析等方法分离，并用核磁共振、质谱、红外、紫外等方法鉴定，从辽西山楂叶中分离出其中黄酮类化合物。周立东18等分离鉴定了北京山楂叶中的黄酮类成分，通过硅胶和聚酞胺柱分离，葡聚糖柱层析
19、纯化，用核磁共振、质谱、红外、紫外和园二色谱等方法确定分离物结构，结果从北京山楂叶中分离到六种黄酮类化合物，分别是球松素、松属素、柯因、抽木柯因、良姜素和高良姜素，其中首次从北京山楂叶中发现球松素、松属素、袖木柯因、良姜素。王小平19等建立了分光光度法测定山楂叶中总黄酮含量，并对该方法进行了方法学考察。薛晓丽20将超临界CO2流体提取工艺与传统的乙醇浸出提取工艺相比较，得出两种方法都有利于山楂叶有效化学成分的提取。乙醇浸出提取工艺有利于提取山楂叶中黄酮类物质，超临界CO2流体提取工艺有利于山楂叶中化学成分的分析的结论。郭志芳21釆用传统乙醇提取法和超临界CO2萃取法提取山楂叶有效成分，采用有机
20、溶刻和桂胶柱层析对超临界萃取物的有效成分进行了分离分析，并釆用有机溶剂提取超临界萃取后的药渣中有效成分，发现峰胶乙醇提取物的总黄酮含量较高，超临界萃取后的药法仍含有较多的总黄酮。卢挺22等在优化实验条件和方法学测试的基础上，对我国山楂叶中的n种黄酮(金合欢素、芹菜素、肉桂酸、高良姜素、阿魏酸、橙皮昔、木犀草素、袖皮素、棚皮素、白黎芦醇和芦丁)用毛细管电泳法进行测定，检出了芦丁、芹菜素和棚皮素外的其他黄酮类化合物。2005年彭增23起等所做的研究，测定了存在山楂叶液体中类黄酮化合物的含量以及对山楂叶液体的抗氧化的能力大小也进行了测定。经现代科学分析，特别是近10年的研究证明，山楂叶所含有的丰富而
21、独特的生物活性物质，使其具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能，对人体有着广泛的医疗、保健作用，是一种具有较高保健功能的产品。1.2 山楂叶中总黄酮的提取方法山楂叶提取物具有活血化瘀、宣通血脉、理气舒络之功效，是一种极具临床应用价值的功能成分。大量研究表明，黄酮类化合物是山楂叶提取物中主要生理活性成分之一。因此，近年来山楂叶黄酮的提取应用研究十分热门。1.2.1 水提法将山楂叶干燥粉碎，加水浸煮23次，冷却后粗滤，滤液离心分离再浓缩沉淀，过滤后真空干燥得疏松固体。本方法操作简单，且不引入溶剂污染，生产的黄酮类化合物适用于配制山楂保健饮品，但产品纯度较低。1.2
22、.2 浸渍法浸渍法24是最为传统的提取方法，是利用一定量的溶剂，在一定温度下，将药材浸泡一定的时间，以提取药材成分。其基本流程25是：山楂叶除去杂质烘干粉碎水浸煮(2次)过滤滤液浓缩沉淀过滤滤液浓缩干燥。用水浸提法生产黄酮，尽管黄酮的提取率稍低、提取液的杂质含量较高，但投资成本低用水浸提法生产黄酮，尽管黄酮的提取率稍低、提取液的杂质含量较高，但投资成本低、可操作性强，并且对环境的污染小，因此具有一定的工业化前景。张黎明26等人考察了山楂叶黄酮的水浸提法工艺。1.2.3 微波提取法当微波加热时，细胞内极性物质尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热量使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和
23、细胞壁冲破，形成微小的孔洞，使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物27。1.2.4 酶解法酶解法是利用酶的高度专一性，将山楂叶细胞壁的纤维素以及细胞间相连的果胶，分解成为小分子物质，减小提取的传动阻力，使山楂叶中黄酮完全释放出来。王晓等用纤维素酶与果胶酶的复合酶提取山楂叶中黄酮类化合物，结果表明：以0.2mg/mL的纤维素酶和0.1mg/mL的果胶酶的复合酸液，在50、pH值为4.5的条件下将山楂叶酶解120min，再在90下浸提90min，总黄酮的提取率比常用方法提高了16.9%。1.2.5 超临界流体萃取技术超临界流体萃取（SCFE）是指在超临界状态下，以超临界流体（SFC）为萃取
24、剂，将一种成分（萃取物）从混合物（基质）中分离出来的技术。常用的萃取剂为CO2，价格低廉且无毒，还可以在近常温的条件下提取分离，能较好地保留有效成分，且无有机溶剂残留，但提取设备一次性投资较大。1.2.6 超声波法超声波提取法21是利用超声波的空化作用，增强物质在溶剂中的溶解能力，加速和增加药材成分提取的一种浸提方法。其基本流程28是：取山楂叶，粉碎成粗粉，加入乙醇水溶液，然后在相应温度下超声提取一定的时间，过滤，滤渣重复提取，将提取液合并。超声提取法29所用溶剂量少，提取时间短，产率较高，在室温下便可进行，设备简单，操作方便，成本小，是提取山楂叶黄酮的一种便捷高效的方法。吕帮玉30等人对影响
25、超声波提取山楂叶黄酮的多个因子进行单因素和正交试验分析，得出超声波法的提取最佳条件为：采用70%乙醇浸提，料液比l:20，温度70，时间50min，超声2次，总黄酮的提取率高达98.87。1.3 山楂叶中黄酮的测定方法1.3.1 分光光度法(1) 可见分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。分光光度法测定山楂叶中的黄酮类化合物是以芦丁为标准品，利用黄酮类物质官能团中的3-OH或5-OH及邻二酚羟基与Al3+络合，形成黄色物质，再加入NaNO2生成红色，在430nm处有最大吸收峰。在一定浓度范围内，其浓度与吸光度值
26、符合朗伯-比耳定律，总黄酮是一系列黄酮类物质的总和，可见光分光光度法测定总黄酮含量的基本原理是根据黄酮类物质母体功能性基团的特异性反应。该方法精密准确、操作简便，从而可以进行比色定量这是当前测定总黄酮所使用最为广泛的方法。(2) 紫外分光光度法由苯甲酰基和桂皮酰基组成的交叉共捉体系存在于大多数黄酮类化合物分子中，其在吸收光谱200400nm的区域范围内有两个紫外吸收带，峰带I(300400nm)和峰带II(220280nm)其中峰带II具有较强的吸收峰，可用紫外分光光度法直接在此特征吸收峰处对试验样品进行测定，从而确定黄酮含量。此法主要根据黄酮化合物自身的特点，无需使用任何显色剂。高红宁31等
27、采用AB-8型号大孔吸附树脂精制苦参中苦参总黄酮。用紫外分光光度法测定得到苦参中总黄酮含量取得满意效果。杨红用聚醜胺前处理益寿胶囊样品后，以淫羊藿苷为对照，釆用紫外分光光度法，在270nm处测定吸收度得出山楂叶中总黄酮的含量。1.3.2 色谱法(1) 高效液相色谱法高校液相色谱法是在经典的液相色谱基础上与气相色谱理论合并，并采用了高效固定相、高压粟和高灵敏度测器等技术。从而使其具有了分离效果明显，准确性好，分析快及仪器自动化程度高等优点。HPLC法分析黄酮类化合物常釆用反相C18色谱柱。Feras Imad Kanaze等釆用HPLC方法从W梧类药物原料与果汁中分离出了桔皮甘、橙皮苷和柚皮苷3
28、种黄酮类化合物。M.Krauze-Baranowska等研究使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)从一些裸子植物树叶中分离出多种黄酮类化合物。刘文海32等通过使用反相液相色谱法(RP-HPLC)分析得出柚子内外皮中声丁的含量。(2) 液相色谱与质谱联用法色谱与质谱联用(LC-MS)是一种新的检测技术，其中色谱是分离手段,质谱是检测手段。此方法对于繁杂样品的预处理要求不同，能够同时测定多种成分。检测的下限可达到pg、ng数量级。对于混合样品的分析具有很高的适应性、选择性和灵敏性、分析速度快、原料浪费减少，应用范围广。莲凌霄33等在高效液相色谱-质谱法测定大豆异黄酮含量的试验中，采用高效液相色谱
29、法分析出大豆中含有的8种异黄酮成分，根据色谱峰的质谱特征分离鉴定出了各异黄酮。1.3.3 纸色谱法纸色谱用于黄酮类分析检测，一般作为定性检测，采用高于临界胶束浓度(CMC)的十二烷基硫酸钠(SDS)，溴化十二烷基甲基卞胺水溶液作展开剂，通过纸色谱法分离和检测桑色素、杨梅黄素等8种黄酮苷和苷元，发现了适宜于分离其黄酮苷类的展开体系。但以此方法进行山楂叶中总黄酮测定时选择性和重现性较差。1.3.4 毛细管电泳法毛细管电泳法几年用于分析天然产物得到较大的发展，科学家用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和葛藤中葛根素、大豆甙元和芦丁含量。毛细管电泳紫外检测法测定实验设备简单方便，价格合理、提取时间短、总
30、黄酮含量较高，适用于山楂叶中黄酮类物质的取及少量生产提取。1.4 总黄酮类化合物应用前景山楂叶中的主要活性物质是黄酮类化合物，黄酮类化合物的作用决定了山楂叶的应用领域。1.4.1 抗心血管病药物 黄酮类化合物在防止心脑血管疾病方面发挥了重要的作用。自80年代起，国内外先后研制开发了以银杏叶提取物制成的各种银杏制剂，内含24%的黄酮(主要由异鼠李素、山奈酚等组成)，适用于脑功能障碍，智力功能衰退，末梢血管血流障碍并伴随的肢体血液不畅。临床上用于治疗冠心病、心绞痛、脑血管疾病等均有良好的疗效34。利用山楂叶总黄酮开发的天然药品是治疗心绞痛、预防动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑血栓 的理想药物，对治疗心绞
31、痛的总有效率为97.1%。此外利用山楂叶中的芸香甙、牡荆素等提取总黄酮制成“益心酮”片，对治疗冠心病的总有效率为90%。1.4.2. 抗肝脏毒药物从紫花水飞蓟种子中提取总黄酮，内含水飞蓟素、异水匕蓟素、次水飞蓟素是常用抗肝素药“益肝宁”、“利肝隆”以及国外“Silimarit”的重要有效成分。具有刺激新的 肝细胞形成，抗脂质过氧化作用，用于治疗肝炎、肝硬化，并能支持肝的自愈能力，改善健康状况26。1.4.3 止咳平喘药80年代我国研制的124种防止气管炎的植物药中就有69种主成分是黄酮类化合物，包括黄酮醇、双氢黄酮及其甙，大多是较好的消炎、止咳、平喘活性成分。1.4.4 天然抗氧化剂黄酮类化合
32、物作为合成抗氧剂如BHT、BHA等替代品具有高效、低毒、廉价、易得的特点，日益受到重视。大量研究表明，茶多酚可以有效地抑制油脂的过氧化物形成和多烯脂肪酸的分解，从而延长了油脂的货架期。茶多酚已在保健食品、鱼油、食用油中得到广泛应用。如从法国桦树皮和葡萄籽中提取的总黄酮制成食用保健品“碧罗芷”被美国FDA认可，经研究表明其具有较好的抗氧自由基作用，比VE强50倍，比VC强20倍，而且能通过血脑屏障，防止中枢神经系统的疾病35。1.4.5 无公害农药 化学合成农药的生产和使用日益受到环境和商业的压力，开发具有特异性功能、靶标专一性较安全的无公害农药显示了广阔的市场潜力。例如豆科植物中异黄酮类化合物
33、，鱼藤酮(rotenone)及类鱼藤酮(rotenoids)均已制成植物类杀虫剂，在农业生产中得以广泛的使用36。1.4.6 在食品行业中的应用随着食品工业的发展和消费水平的不断提高，人们越来越注重强身键体，改善饮食习惯，提高生活质量。于是保健食品以其天然性、食效性等特点在世界范围内成为人们追逐的目标。由于葛根黄酮的保健作用确有实效37，东南亚及欧美各国最近掀起以葛根黄酮为代表的开发应用热潮。据报道，国际市场上葛根黄酮含量40%的为300元/kg左右，含量达80%以上的为25004000元/kg，含量90%以上的为1000015000元/kg。据不完全统计，2010年我国保健品市场销售额将达1
34、000亿元。在众多的天然活性成分中黄酮类化合物是极有应用潜力的资源之一。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，因此近十多年来各国科学家都积极关注着从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等特异功能的保健食品和药品等产品。这些产品对于调节人体生理功能，提高生命运动质量，为食用者带来健康体魄。目前黄酮类化合物一般可采取如下两种利用方式：(1) 直接应用含黄酮的植物提取液制成保健品食品；(2) 将含黄酮的植物提取液经浓缩、分高纯化、干燥等精制步骤，制取高纯度的黄酮类化合物。1.5 课题研究的目的、主要内容及其
35、意义1.5.1 课题研究的目的山楂叶中的黄酮类化合物具有非常重要的药理性作用38。在人体生理学、病理学、药理学、中医药化学、药剂学等多种学科领域被涉及。为了可以更合理的开发利用这一宝贵资源，本课题通过提取山楂叶中黄酮以及测定山楂叶中总黄酮的含量的实验，确定较佳提取溶剂，提取方法和提取操作条件。为以后的更广泛的应用这一资源提供基础科学依据。1.5.2 课题研究的主要内容本文用芦丁标准溶液做出标准曲线，采用可见光分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量，通过改变提取溶剂和提取方法，确定较佳的提取溶剂和提取方法。并对实验精密性、稳定性进行测定，并给出数据及分析。拟寻找出一种准确而简便的测定山楂叶中总黄酮含
36、量的方法，为合理科学开发这一宝贵的中药资源，深入研究其确切的药理作用提供可靠的理论和实验依据。1.5.3 课题研究的意义黄酮是山楂叶中的最主要的活性物质，经现代科学分析，具有抗菌、消炎、止痒、抗氧化、增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种功能39，对人体有着广泛的医疗、保健作用，是一种具有较高保健功能的物质。因此，研究和开发山楂叶中类黄酮化合物成为研究热点，本课题探究提取和检测山楂叶中的黄酮具有重要意义。目前测定山楂叶中的黄酮的方法有：分光光度法，色谱法，纸色谱法，毛细管电泳法。上述各种方法各有各的优势，通过大量文献查阅比较各种方法的优缺点，经小组讨论，用分光光度法测定山楂叶中黄酮含量较为经济
37、且测量数据结果较为准确。分光光度法具有灵敏度高，选择性好，精密度和准确度较高，分析速度快，设备简单，操作方便等优点。分光光度法的应用范围广涉及化学化工、医疗卫生、食品饮料、农业化肥、畜牧水产、机械制造、计量科学、环保、制药、生物、材料、石油等领域中的科研、教学、生产中的质量控制、原材料和产品检验40等各个方面，进行定性分析、定量测定、纯度检查、动力学研究等等。因此，利用分光度法检测山楂叶中的总黄酮含量具有重要意义。第二章 实验部分2.1 实验原理测量山楂叶中的黄酮含量时，一般采用芦丁供试品做标准物质，因为芦丁具有与总黄酮相似的结构，在可见光区，两者的吸收峰相似，所以可用来测定总黄酮的含量。本实
38、验以Al(NO3)3-NaNO2做显色试剂，用芦丁标准溶液绘制出标准曲线，得出回归线方程A=b x + a。测量山楂叶中的总黄酮的含量时，将所测得的吸光度带入回归方程，用以下公式进行计算得出总黄酮含量。 (由比尔定律推导得出) (2-1)式中：A -吸光度 C -样液中黄酮标定浓度，(g/mL)a,b -由工作曲线求得随后进行芦丁供试品溶液精密度试验，利用不溶媒提取山楂叶中的黄酮，确定较佳的提取溶媒。通过用不同的方法提取山楂叶中的黄酮，确定较好的提取方法。通过改变提取操作条件确定合适操作条件。然后进行精密性、稳定性和重复性试验。最后进行加样回收试验，计算黄酮含量。2.2 实验仪器与试剂2.2.
39、1 实验仪器表2-1 主要实验仪器仪器型号数量生产厂家可见光分光光度计722s1上海仪电分析仪器有限公司超声清洗仪XO-4200DT型1南京先欧仪器制造有限公司分析天平FA2004N1上海精密科学仪器有限公司循环水多用真空泵SFHB-3型1南京先欧仪器制造有限公司台式离心机80-2B型1上海安亭仪器厂真空干燥箱ZK-82A型1上海市试验仪器总厂2.2.2 实验试剂表2-2 主要实验仪器试剂分子式分子量纯度生产厂家山楂叶/淄博：杨村山楂园乙醇C2H5OH46.07分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司甲醇CH2OH31.03分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司亚硝酸钠NaNO268.99分析纯天津市巴
40、斯夫化工有限公司硝酸铝Al(NO3)3212.99分析纯天津市巴斯夫化工有限公司氢氧化钠Na(OH)36.5分析纯天津市巴斯夫化工有限公司芦丁标准品C27H30O163H2O610.52分析纯贵州迪大科技有限公司2.2.3 试剂的制备(1) 0.05g/mL NaNO2溶液：在分析天平上称取5.0012g亚硝酸钠固体（不含结晶水），加去离子水溶解，转移到100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(2) 0.1g/mL Al(NO3)3溶液：在分析天平上称取9.9972g硝酸铝固体（不含结晶水），加去离子水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(3) 0.04g/mL NaOH溶
41、液：在分析天平上称取4.0008g氢氧化钠固体（分析纯），加去离子水溶解，转移到100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(4) 60%甲醇：量取60mL无水甲醇于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。(5) 40%、50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇溶液：分别量取40mL，50mL，60mL，70mL，80mL，90mL无水乙醇于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。2.3 分光光度法测定山楂叶中总黄酮的含量2.3.1 芦丁对照品溶液的制备30精密称取105干燥至恒重的芦丁标准品25.0007g置50mL容量瓶中，加无水乙醇适量，超声溶解，放冷恢复至室温，并用无水乙醇定
42、容至刻度线，摇匀。精密量取上述液20mL，置于50mL的容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的芦丁对照品溶液，置于棕色瓶中待用。2.3.2 标准曲线的绘制(1) 芦丁标准液的制备精密吸取0.2mg/mL的芦丁对照品溶液0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL分别置于7个50mL容量瓶中，依次加去离子水12mL、10mL、8mL、6mL、4mL、2mL、0mL使总体积均达到12mL，然后各自加入0.05g/mL NaNO2溶液2mL，摇匀，放置6min，再加入0.1g/mL Al（NO3）3溶液2mL和0.04g/mL NaOH溶液20mL，加水稀释至刻度
43、，摇匀，放置1h。(2) 最大吸收波长的选取分别选取7组芦丁对照品溶液，用紫外-分光光度计在不同的波长下测定其吸光度，选取最大的吸收波长。(3) 吸光度的测量待芦丁标准溶液与空白液静置1h后，在波长为510nm处，以空白液为参比测出其吸光度。(4) 标准曲线的绘制以总黄酮含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程。2.3.3 山楂叶中黄酮含量的测定(1) 样品处理取采摘的山楂叶，洗净，置于干燥箱中烘干，将烘干的山楂叶用粉碎机粉碎，过60目筛，得山楂叶粗粉。(2) 供试品溶液的制备准确称取1.0003g粗粉放入带塞的100mL三角瓶中，加入50%乙醇溶液50mL在60下，用40Hz超
44、声波提取40min，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液，准确移取提取液10mL，置100mL量瓶中，加入0.05g/Ml NaNO2溶液2mL，摇匀，放置6min，再加入0.1g/mL Al（NO3）3溶液2mL和0.04g/mL NaOH溶液20mL，加水稀释至刻度，测定吸光度值。(3) 吸光度的测量待供试品与空白液静置1h后，在波长为510nm处，以空白液为参比测定其吸光度值。 2.4 超声波提取工艺研究2.4.1 提取溶媒的选择准确称取3份山楂叶粉末1.0000g，分别置于具塞锥形瓶中，分别在以下三种条件下超声处理：(1) 70%乙醇，料液比1(g):20(mL)，温度70，时间50mi
45、n。(2) 60%甲醇，料液比1(g):20(mL)，温度70，时间40min。(3) 水，料液比1(g):30(mL)，温度80，时间40min。分别进行抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，在波长510nm处测定不同溶媒提取液的吸光度。比较数据结果，得较佳的提取溶媒。2.4.2 超声波提取单因素试验本论文中采用单因素法对超声波提取工艺进行研究。(1) 乙醇浓度对黄酮提取率的影响精确称取1.000g山楂叶粉末，分别用浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇水溶液在50下，料液比(g/mL，下同)1:20，超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值,得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。(2) 料液比对总黄酮提取率的影响精确称取1.000g山楂叶粉末，60%乙醇在60下，料液比分别为1:12、1:16、1:20、1:24、1:28超声提取40min，抽滤，将滤液用水稀释定容至50mL，静置2h后，离心20min，取上层清液1mL，测定其吸光值，得总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。(3) 提取时间对总黄酮提取率的影响精确称取1.000g