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1、PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTA
2、GC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应
3、的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简介-定义 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCR技术是一种体外模拟自然技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技
4、术。它核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。片断。 简单的讲，简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向个区域而进行的重复双向DNA合成。合成。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于
5、引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分
6、析与检测用。 PCR技术简介PCR反应所用酶：反应所用酶： 早期的早期的PCR方法采用大肠杆菌方法采用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。有一些错配，导致产物大小不均一。 耐热耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热水聚合酶是从一种嗜热细菌嗜热
7、水生菌种提纯出来的，经生菌种提纯出来的，经95持续温育仍有活性，持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。扩增更长的产物。()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 201234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应
8、条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。操作方法 1 在PCR反应管中加入buffer2.5ul 2 向PCR加入dntp0.5ul 3 加入primer 0.5ul 4 加入模板0.5ul 5 加酶0.5ul 6 加水20.5ul，至总体积为25微升？按紧盖子， 轻轻混匀， 放入PCR仪 如何加样才能加得准？5 反应
9、条件 942-5分钟 94 40sec 57 40sec 72 1min 30sec 72 10min30-35cycle电泳缓冲液的配制 50TAE Buffer 配制方法： 1 称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2 向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。 使用时稀释50倍 即1TAE Buffer 1.5%电泳 按照5份PCR产物与一份6loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入胶中，其中一孔加一份Marker对照
10、，电泳，电压120，电泳半个小时，放入EB染色液中，染色半个小时，。PCR技术简介 PCR常见问题：常见问题：一一.出现假阴性；出现假阴性；二二.出现假阳性；出现假阳性；三三.出现非特异性扩增带；出现非特异性扩增带；四四.出现片状拖带或涂抹带。出现片状拖带或涂抹带。PCR技术简介一一.PCR出现假阴性原因：出现假阴性原因： 1模板因素：模板因素： 2酶失活：酶失活： 3引物：引物： 4Mg2+浓度：浓度： 5反应体积的改变：反应体积的改变： 6物理原因：物理原因： 7靶序列变异：靶序列变异：PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 模板因素：模板因素：（1）模板中含有杂蛋
11、白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留， 特别是染色体中的组蛋 白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 模板因素引起假阴性解决方案：模板因素引起假阴性解决方案：1.配制有效而稳定的消化处理液;2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模板DNA的溶解液应固定不变。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 酶失活：酶失活：1.酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.酶存放时间太长；3.酶存放方式不当，或其他意外原因；4.忘记添加Taq酶。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴
12、性原因分析及解决方案方案 酶失活引起假阴性解决方案：酶失活引起假阴性解决方案：1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶；2.更换新的Taq酶;3.新旧两种Taq酶同时使用。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 引物：引物：1.引物质量；2.引物浓度；3.两条引物的浓度是否对称等。 PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 引物引起假阴性解决方案引物引起假阴性解决方案:1.选定一个好的引物合成单位选定一个好的引物合成单位;2.引物浓度不仅要看引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔值，稀释时更要平衡其摩尔浓度；浓度；3.引物应高浓度小量分装
13、保存，防止反复冻融或长引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；求合成单位将固体分装；4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。引物之间形成二聚体等。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 Mg2+浓度：浓度： Mg2+浓度对浓度对PCR扩增效率影响极大，扩增效率影响极大，浓度过高可降低浓度过高可降低PCR扩增的特异性；扩增的特异性；浓度过低则影响浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使扩增产量甚至使PC
14、R扩增失败，出现假阴性。扩增失败，出现假阴性。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 Mg2+浓度引起假阴性解决方案：浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应设置一组反应，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而等），而MgCl2浓度不浓度不同（由同（由0.56mmol/L,每次增加每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳，由此来摸索最佳Mg2+浓度。浓度。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 反应体积的改变：反应体积的改变： 做小体积做小体积PCR后，再做大体积时，后，再做大体
15、积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。则易失败。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 物理原因：物理原因：1.变性温度低，变性时间短；变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低合而降低PCR扩增效率；扩增效率；3.延伸时间过短等。延伸时间过短等。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 物理原因引起假阴性解决方案：物理原因引起假阴性解决方案：1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次循
16、环，必要时可设为95 ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45 ，然后再逐次提高（以2 /次为宜）。3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。PCR出现假阴性原因分析及解决出现假阴性原因分析及解决方案方案 靶序列变异：靶序列变异： 靶序列变异导致假引性的情况常靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失性引物与之结合部的中间，使引物失效。效。 解决方案：解决方案： 根据已知序列重新选择区段设计
17、引根据已知序列重新选择区段设计引物。物。PCR技术简介技术简介二二.PCR出现假阳性原因：出现假阳性原因：1.引物设计不合适；2.靶序列或扩增产物的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；（2）空气中的小片断核酸污染。 PCR出现假阳性原因分析及解决方案 引物设计不合适：引物设计不合适： 1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。 解决方案：解决方案： 选择特异性强的区段设计引物。选择特异性强的区段设计引物。PCR出现假阳性原因分析及解决方案 整个基因组或大片段的污染的解决方整个基因组或大片段的污染的解决方案：案：
18、1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。PCR出现假阳性原因分析及解决方案 空气中的小片断核酸污染：空气中的小片断核酸污染： 这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。 解决方案：解决方案： 运用巢式PCR来减轻或消除。PCR技术简介三三.出现非特异扩增带原因：出现非特异扩增带原因：1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；2.Mg2+浓度过高，退火温度
19、过低，PCR循环次数过多；3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。PCR技术简介 PCR出现非特异扩增带解决方案：出现非特异扩增带解决方案：1.必要时重新设计合成引物；必要时重新设计合成引物；2.减低酶量或调换另一来源的酶；减低酶量或调换另一来源的酶；3.降低引物量，适当增加模板量，减小降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数；循环次数；4.适当提高退火温度或采用二温度点法适当提高退火温度或采用二温度点法（94 变性，变性，65 左右退火与延伸）。左右退火与延伸）。PCR技术简介 PCR出现片状拖带或涂抹带原因出现片状拖带或涂抹带原因：1.酶量过多或酶的质量差；2.dNTP浓度过高；3. Mg2+浓度过高,退火温度过低;4.循环次数过多。PCR技术简介 PCR出现片状拖带或涂抹带解决方出现片状拖带或涂抹带解决方案案:1.减少酶量或调换另一来源的酶；2.减少dNTP浓度；3.适当降低Mg2+浓度；4.增加模板量，减少循环次数。