《温州医学院 临床免疫学检验系列 (4).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《温州医学院 临床免疫学检验系列 (4).ppt（13页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、实验一抗血清的纯化,概述,抗血清：机体经抗原免疫后含特异性抗体的血清抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在非特异性抗体和其他血清成分。抗血清纯化的目的是尽量去除抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止其对实验结果产生影响。,抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。前者常用硫酸铵盐析法，后者分非特异性和特异性两种类型。-非特异性方法：葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法-特异性方法：免疫吸附法盐析分离的抗体中含有大量盐分，需要将沉淀复溶进行去盐处理才能应用，通常采用凝胶过滤法或透析法。,实验目的,本次实验利用硫酸铵盐析法对抗血清进行初步纯化，并用凝胶过滤法对纯化后的抗体进行脱盐处理
2、。通过本次实验，理解抗血清纯化的目的和方法，并熟悉其操作过程。,实验原理,盐析：不同性质的蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清免疫球蛋白（Ig）在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将两者分离。分离纯化Ig最常用硫酸铵（中性盐），33%的硫酸铵可以选择性沉淀IgG。凝胶过滤法：也称分子筛层析法，是利用具有网状结构的凝胶颗粒的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,实验材料,试剂：葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）、饱和硫酸铵溶液、0.2mol/LPBS（pH7.0）器材：离心管、层析柱、铁架台、核酸蛋白检测仪、紫外分光光度计、一次性滴管、烧杯
3、标本：抗血清,实验步骤,（一）盐析取2ml抗血清于15ml离心管中，加入2mlPBS。室温下，边摇动离心管边滴加2ml饱和硫酸铵溶液。置室温15min后，离心3500rpm10min，弃上清。沉淀物用2mlPBS重悬。,（二）凝胶过滤装柱在层析柱中先加入少量PBS将出水管中的气泡赶掉，再将SephadexG-25凝胶液搅匀倒入层析柱中。层析柱中的液面边下降边加SephadexG-25凝胶液，一直到柱中凝胶实体高度到达层析柱高度的三分之二左右时，停止加凝胶液。平衡柱子用PBS平衡柱子5min，平衡后将柱子的出水口和核酸蛋白检测仪连接。,调节核酸蛋白检测仪选择波长为280nm，调0和调100。,电
4、源,2A时调0钮,电压选择钮,进水口,100%时调100钮,波长选择钮,出水口,加样当柱子中的PBS液面和凝胶柱的上表面相切时，将制备好的蛋白质重悬液沿着层析柱的内壁慢慢地加入，待重悬液的液面和凝胶柱的上表面相切时，加入PBS。边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化，当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体，当数值下降到10时，停止收集。用紫外分光光度计检测收集液的OD280和OD260。,实验结果,蛋白质含量（mg/ml）=（1.45OD2800.74OD260）稀释倍数（注：1.45和0.74是常数）,注意事项,滴加饱和硫酸铵时要边滴边摇匀，防止局部浓度过大装柱之前注意赶气泡，装柱时凝胶需轻轻搅拌均匀，凝胶的量以实体高度达到层析住高度的三分之二为宜样品上柱过程注意前后两次相切始终保持层析柱中凝胶上方有液体，否则凝胶柱会干燥破裂,