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1、,第三章免疫原和抗血清的制备,温州医科大学检验医学院高基民,第一节免疫原的制备第二节免疫佐剂第三节抗血清的制备第四节抗血清的鉴定和保存第五节抗血清的纯化总结,内容提要,第一节免疫原的制备,免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质颗粒性抗原细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸,细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵,一、颗粒性抗原的制备,组织细胞抗原的制备：高速捣碎法组织捣碎机捣碎研磨法用玻璃匀浆器或乳钵研磨,（一）可溶性抗原的制备,二、可溶性抗原的制备和纯化,组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备：反复冻融法-20冻结
2、，然后室温融化超声破碎法超声波（120kHz）自溶法自身酶系酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶表面活性剂处理法SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴,免疫球蛋白片段的制备：非共价键解离法改变pH、利用强变性剂共价键解离法氧化法和还原法溴化氰裂解法酶解法木瓜酶、胃蛋白酶,超速离心法：差速离心法低速和高速离心交替进行密度梯度离心法区带离心法,（二）可溶性抗原的纯化,选择性沉淀法：核酸去除法氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素盐析法硫酸铵、硫酸钠有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮聚合物沉淀法聚乙二醇,离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂,凝胶过滤法：利用凝胶的分
3、子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离,亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力(1)亲和层析支持物的选择：非特异性吸附低；液体流速快；在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结合；有丰富的微孔，以增加结合容量。最常用的支持物是Separose4B,(2)配体的选择条件：抗原或抗体必须单一特异性；抗原与抗体必须具有较高的亲和力；配体必须有一个适当的化学基团。,(3)抗原或抗体与支持物的结合：活化：溴化氰；接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。,(4)亲和层析条件的选择：封闭活性基团：用无关蛋
4、白质或三乙醇胺过柱；除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理；解脱剂：3mol/L硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液,电泳法：利用分子量和电荷量不同进行分离,（三）纯化抗原的鉴定,蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA,三、半抗原性免疫原的制备,半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等,载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质
5、,蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白牛甲状腺球蛋白血蓝蛋白多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine）大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose,CMC)聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）,（一）载体,物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原吸附的载体有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等,（二）半抗原与载体的连接方法,化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上带有游离氨基或羧基以及两种基团都有的半抗原：碳二亚胺法戊二醛法混和酸酐法过碘酸氧化法不带氨基和羧基的半抗原：用化学方法使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，再与
6、载体连接,（三）半抗原性免疫原的鉴定,一个载体分子至少要连接20个以上的半抗原分子,半抗原与载体的比例测定：吸收光谱分析法放射性核素标记半抗原渗入法,第二节免疫佐剂,免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。,化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸胞苷酸(polyIC)、脂质体生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白,用于人体的佐剂：氢氧化
7、铝、明矾、polyIC、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freundsadjuvant),一、佐剂的种类,弗氏佐剂(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐剂羊毛脂与液体石蜡的混合物弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂加卡介苗,乳化方法：研磨法和搅拌混合法,改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。刺激淋巴细胞增殖和分化。,二、佐剂的作用机制,第三节抗血清的制备,抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对
8、某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体,多克隆抗体的产生示意图,多克隆抗体(polyclonalantibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物,抗原来源与动物种属的关系种属差异越远，免疫原性越强动物个体的选择适龄、健康、体重符合要求抗原的性质,一、免疫动物的选择,免疫原的剂量中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体免疫间隔时间第一次和第二次间隔1020天，三次及以后间隔710天免疫途径皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结,二、免疫程序,颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊心脏采血法：家兔、豚鼠、大鼠、鸡静脉采血法：家兔、山羊、绵羊,三、动物采血法,
9、第四节抗血清的鉴定和保存,抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法抗体效价的鉴定：凝集试验、双向免疫扩散试验、ELISA抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验,一、抗血清的鉴定,28保存：短期保存冰冻保存：保存5年真空干燥保存：保存510年,二、抗血清的保存,第五节抗血清的纯化,抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。,盐析法：硫酸铵盐析法、硫酸钠盐析法凝胶过滤法：常结合盐析法离子交换层析法：DEAE纤
10、维素、QAE-sephadex、QAE纤维素亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose4B制成亲和层析柱,一、特异性IgG抗体,亲和层析法：杂抗原交联Sepharose4B柱吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗原混合液制成固相吸附剂,二、单价特异性抗血清,总结,免疫原是诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。半抗原是指仅有抗原性而无免疫原性的物质，与载体结合后可具有免疫原性。免疫佐剂是先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。抗血清是经过抗原免疫的动物血清。在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。,