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1、实验五酶联免疫吸附试验,概述,酶联免疫吸附试验（ELISA）是临床最常用的酶免疫分析技术，属于固相酶免疫测定。三个关键材料：固相的抗原或抗体、酶结合物、酶作用的底物方法类型：夹心法、竞争法、间接法、捕获法,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、
2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特
3、异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,实验目的,本次实验以双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为例，来验证酶联免疫吸附试验的基本原理，并通过实验熟悉其操作过程及临床应用,实验原理,筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接于固相载体制备酶标反应板，另一种标记过氧化物酶制备酶标抗体；测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物；加入底物后显色，并通过测定吸光度来判读结果。,实验材料
4、,试剂：酶标记反应板、酶结合物、底物A、B液、终止液、洗液、阳性质控血清、阴性质控血清器材：加样枪、加样头、水浴箱、酶标仪标本：待测血清13（高、中、低浓度）,实验步骤,加样：分别加入13号标本各50l（做双孔），在7、8孔位分别加入阴、阳性对照各一滴（50l），37水浴箱60分钟。加酶结合物：各孔加入酶结合物各一滴（50l），混匀，置37水浴箱30分钟。洗板：弃去，加洗涤液注满各孔，静置30秒，弃去，拍干，重复5次。显色：分别加入底物A、B液各一滴，混匀，置37水浴箱10分钟。加终止液：每孔加50l。比色：用酶标仪测定吸光度，波长设定为450nm。,实验结果,注意观察质控血清的测定结果是否在控，以确保实验结果的准确性以样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）2.1时判定为阳性,注意事项,所有试剂需平衡至室温再开启使用加入试剂或标本后需轻轻振荡洗涤过程要标准化严格控制反应时间和显色时间,临床应用,ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝两对半”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。,