核酸的结构与性质.ppt

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1、课程内容核酸部分,静态生物化学核酸的研究历史核酸的结构核酸的性质动态生物化学核酸的降解与核苷酸代谢,Nucleicacid,HistoryofnucleicacidNucleotidesarethebuildingblocksofnucleicacidsDNAandRNAstructureNucleicacidproperties,DNAasGeneticMaterial(before1953),HistoryofNucleicAcids(before1953),1869SwissphysicianandbiologistFriedrichMiescherdiscovered“nuclein”

2、fromnucleiofwhitebloodcells.1889Theterm“nucleicacid”wasfirstusedbyRichardAltmann.1920sThetetranucleotidehypothesisisintroduced.1938AstburyandBellpublishfirstX-raydiffractionpatternofDNA,indicatedperiodicity.1944Avery,MacLeod,andMcCartydemonstrateDNAcould“transform”cells.Late1940sErwinChargaffusedpap

3、erchromatographyforseparationofDNAhydrolysates.Amountofadenineisequaltoamountofthymineandamountofguanineisequaltoamountofcytosine.1951Furbergpublishedthecrystalstructureofanucleoside(cytidine).1952HersheyandChaseconfirmDNAisamoleculeofheredity.1953WatsonandCrickdeterminethestructureofDNA.,HistoryofD

4、NA,1869DNAwasfirstidentifiedbyFriedrichMiescher,aSwissbiologist.Hecalledthesubstancenuclein,notedthepresenceofphosphorous,andseparatedthesubstanceintoanacidicpart(whichwenowknowisDNA)andabasicpart(aclassofbasicproteinsthatbindtoacidicDNA).1889Theterm“nucleicacid”wasfirstusedbyRichardAltmann,aGermanp

5、athologistandhistologist.,FriedrichMiescher,FriedrichMiescher(Swiss,1844-1895)IntelligentfromearlyagebutveryshyStudiedattheUniversityofTbingen(图宾根大学)underHoppe-Seyler,consideredthefatherofbiochemistry,FriedrichMieschersdiscovery,HeexaminedusedbandagesobtainedfromahospitalcaringforthewoundedoftheCrim

6、eanWarinhopeoffindingsomethinginterestingHediscoveredasubstancecontainingbothphosphorusandnitrogen,madeupofmoleculesthatwereapparentlyverylarge,inthenucleiofwhitebloodcellsfoundinpusNamedthesubstancenucleinbecauseitseemedtocomefromcellnuclei.In1874whenMiescherseparateditintoaproteinandanacidmolecule

7、.Itisnowknownasdeoxyribonucleicacid(DNA),Hoppe-Seyler,ThissubstancewassounusualthatHoppe-SeylerrepeatedtheworkhimselfbeforeallowingMieschertopublishthepaperonthediscoveryHefoundanexcellent(andmorepleasant)sourceofnuclearmaterialinthespermofthesalmonThenucleiarelargeinanyspermcells,remarkablysointhes

8、almonsFromthesehefirstextractedapureDNA,TetranucleotideHypothesis,PhoebusLevene(Russian-American,1869-1940)(sugarinDNAandchemicalbond)HeworkedwithAlbrechtKossel(base,NobelPrize)andEmilFischer,thenucleicacidandproteinexpertsattheturnofthe20th.century,TetranucleotideHypothesisNucleicacidisarepetitivep

9、olymeroffoursubunitsA:C:G:Tintheratio1:1:1:1=structureseemstoosimpletocarryinformation,FrederickGriffith,In1928,Griffithsexperimentinvolvedmiceandtwotypesofpneumonia,avirulentandanon-virulentkind.Heinjectedthevirulentpneumoniaintoamouseandthemousedied.Nextheinjectedthenon-virulentpneumoniaintoamouse

10、andthemousecontinuedtolive.Afterthis,heheatedupthevirulentdiseasetokillitandtheninjecteditintoamouse.Themouselivedon.Lastheinjectednon-virulentpneumoniaandvirulentpneumonia,thathadbeenheatedandkilled,intoamouse.Thismousedied.,GriffithsTransformationExperimentPneumococcusbacteriaincludetwostrains,avi

11、rulentIIISstrainwithaSmoothcoatthatkillsmice(left),andanon-virulentIIRRoughstrainthatdoesnot(middle).HeatingdestroysthevirulenceofIIIS(right).Whenheat-killedIIISismixedwithliveIIRandinjectedintomice,themousedies,anditstissuecontainslivingbacteriawithsmoothcoatslikeIIIS,andthesebacteriaaresubsequentl

12、yvirulenttomice.Somethingintheheat-killedIIISbacteriahastransformedthebiologicalandhereditarypropertiesoftheIIRbacteria.,Why?,Griffiththoughtthatthekilledvirulentbacteriahadpassedonacharacteristictothenon-virulentonetomakeitvirulent.Hethoughtthatthischaracteristicwastheinheritancemolecule.Thispassin

13、gonoftheinheritancemoleculewaswhathecalledtransformation.,Intheearly1940sOswaldT.AveryandMaclynMcCarty,acolleagueattheRockefellerInstituteHospital,beganconcentratingontheproblemofPneumococcaltransformation.,“TransformingPrinciple”identifiedasDNA,Inthisexperimenthedestroyedthelipids,ribonucleicacids,

14、carbohydrates,andproteinsofthevirulentPneumonia.Transformationstilloccurredafterthis.Nexthedestroyedthedeoxyribonucleicacid.Transformationdidnotoccur.Averyhadfoundtheinheritancemolecule,DNA!,肺炎球菌转化试验,AverysisolationoftheTransformingPrincipleAveryrepeatedGriffithsexperimentofcombiningheat-killedvirul

15、entIIISbacteriawithnon-virulentIIRbacteria.Inordertoisolatethetransformingsubstance,hefractionatedtheheat-killedIIIScellsandselectivelyremovedcarbohydratesandlipids,leavingbehindproteinsandnucleicacids.,Biochemicalassaysfortransformation,Treatmentwithproteolyticenzymes(trypsin,chymotrypsin)didnothav

16、eanyeffectonthetransformationactivity.Treatmentwithribonuclease(knowntodigestRNA)hadnoeffectonthetransformationactivity.Treatmentwithdeoxyribonuclease(knowntodigestDNA)destroyedthetransformationactivity.,Detailedmechanism,ErwinChargaffTounderstandtheDNAmoleculebetter,scientistsweretryingtomakeamodel

17、tounderstandhowitworksandwhatitdoes.Inthe1940sanotherscientistnamedErwinChargaffnoticedapatternintheamountsofthefourbases:adenine,guanine,cytosine,andthymine.HetooksamplesofDNAofdifferentcellsandfoundthattheamountofadeninewasalmostequaltotheamountofthymine,andthattheamountofguaninewasalmostequaltoth

18、eamountofcytosine.Thusyoucouldsay:A=T,andG=C.ThisdiscoverylaterbecameChargaffsRule.,DNA碱基组成的Chargaff规则,Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在1950年总结出DNA碱基组成的规律：腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T。鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即G=C。含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T。嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。,Hershey置65水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电

19、泳检测酶切反应的结果;反应体系：10内切酶缓冲液2lDNA1-1.5g限制性内切酶2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，371小时。可根据需要按比例放大。,pGFPuv和pBSK的酶切体系,充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37保温3-4小时或过夜，65保温10分钟使限制性内切酶失活。,酶活力的定义:在标准条件下,1小时完全消化1g线型DNA分子所需的酶量定义为1U。影响限制性内切酶活性的生物因子：酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；识别序列在DNA中的分布频率；与DNA的构象有关（SC,L,OC）；DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；,内切酶用量不超过总反应体积

20、的10%；消化时间适当延长有利于提高酶活性；加DNAse-free的BSA可以起到稳定酶活性的作用；用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用；DNA样品应不含重金属离子。,在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步：T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。,DNA的连接,TheoreticalBasisofAgaroseGelElectrophoresis,Agar

21、oseisapolysaccharidefrommarinealagethatisusedinamatrixtoseparateDNAmoleculesBecauseDNAisa(-)chargedmoleculewhensubjectedtoanelectriccurrentitwillmigratetowardsa(+)pole,PouringanAgaroseGel,SizingaPieceofDNA,ThedistancetheDNAmigratesisdependentuponthesizeoftheDNAmoleculethesecondarystructureoftheDNAth

22、edegreeofcrosslinkinginthegelmatrixSizeofDNAmoleculecanbedeterminedbyusingstandardsofknownmolecularweight,PartIII核酸的解离,核酸的碱基、核苷和核苷酸都能发生解离1.碱基的解离：嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮2.核苷的解离：糖对碱基的解离产生影响3.核苷酸的解离：磷酸基引起的两个解离常数pK10.7-1.6pK25.9-6.5,pK1=0.8第一磷酸基,pK3=6.3第二磷酸基,pK2=4.3含氮环,胞嘧啶核苷酸,pK1=1.0第一磷酸基,pK3=6.4第二磷酸基,烯醇式羟基,尿嘧啶核苷

23、酸,pH,离子化程度,PartIV核酸的紫外吸收,嘌呤碱和嘧啶碱分子中均具共轭双键体系，在紫外区有吸收（240-290nm，最大吸收在260nm左右）。,DNA的紫外吸收光谱,1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸收值,Hyperchromicity（增色效应）,DNAsolutioncharacteristicallyshowsanabsorbancemaximumat260nm(intheUVregionofthespectrum).IfthesameDNAsolutionismelted,theabsorbanceat260nmincreases.Thispropertyisterm

24、edhyperchromicity.Thehyperchromicshiftisduetothefactthatunstackedbasesabsorbmorelightthanstackedbases.,PartV核酸的变性、复性与分子杂交,变性定义：稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。氢键断裂，不涉及到共价键的断裂。变性表征：生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素：pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度加热,变性,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此

25、，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。(加热变性使DNA双螺旋结构失去一半时的温度）一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44,热变性和Tm,影响Tm的因素GC含量溶液的离子强度溶液的pH变性剂,（G+C）%=（Tm-69.3）2.44,TmvsGCContent,ThermaldenaturationofDNA,Tm:Intheprocessofthermaldenaturation,Tmis

26、apointatwhich50%oftheDNAmoleculeexistsassinglestrands.Tmisprimarilydependentupon1)BasecompositionofthatDNAmolecule.2)Chemicalnatureofthesolventand3)theidentitiesandconcentrationsofionsinthesolutionWhenthermallymeltedDNAiscooled,thecomplementarystrandswillagainre-formthecorrectbasepairs,inaprocesster

27、medannealingorhybridization.,核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性（Renaturation)。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”(annealing)。退火温度Tm25复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,分子杂交(Hybridization),DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新

28、分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。,点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。,Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。,Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,Southern印迹法,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,本章小结,核酸是遗传物质载体的证明和研究历史1

29、944Avery,MacLeod,andMcCartydemonstrateDNAcould“transform”cells.Somedoubtremained.AveryrepeatedGriffithsexperimentofcombiningheat-killedvirulentIIISbacteriawithnon-virulentIIRbacteria.Inordertoisolatethetransformingsubstance,hefractionatedtheheat-killedIIIScellsandselectivelyremovedcarbohydratesandli

30、pids,leavingbehindproteinsandnucleicacids.1952HersheyandChaseconfirmDNAisamoleculeofheredity.proteinslabeledwith35S,DNAlabeledwith32P,双螺旋模型（Watson和Crick于1953年提出）,DNA双螺旋（B-DNA）是两条反向平行的多核苷酸链围绕同一假想的中心轴缠绕形成的右手双螺旋。糖和磷酸形成每条链的骨架，暴露在螺旋的表面，碱基堆积在螺旋的内部，一条链上的碱基与另一条链上的碱基形成位于同一平面的碱基对。腺嘌呤总是与胸腺嘧啶配对（通过二个氢键），而鸟嘌呤总是与胞

31、嘧啶配对（通过三个氢键）碱基配对，因此双螺旋中的一条链与另一条链互补。相邻碱基对的距离为0.34nm，沿着螺旋的长轴每一转含有10个碱基对，螺距为3.4nm。螺旋的表面形成大沟和小沟。碱基堆积相互作用是稳定双螺旋的主要作用力。,核酸的化学结构,1.核酸是由构件分子核苷酸组成的线性聚合物，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。每一个核苷酸都是由一个戊糖（对于DNA是2-脱氧核糖，对于RNA是核糖）通过N-糖苷键与一个杂环碱基（嘌呤或嘧啶）连接组成的，糖的5C位通过酯键连接一个磷酸基团。2.每一个核苷酸的磷酸基团通过与相邻的另一个核苷酸的3羟基形成的酯键将各个核苷酸连接起来形成聚核苷酸和

32、核酸。由于一个磷酸分别在两个核苷酸的3和5位都形成了酯键，所以连接两个核苷酸的含有两个酯键的桥梁称之为磷酸二酯键。核酸酶可以在3或5位水解磷酸二酯键。,3.嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤既出现在DNA中，也出现在RNA中，出现在DNA中的嘧啶碱基是胞嘧啶和胸腺嘧啶，而出现在RNA中的主要是胞嘧啶和尿嘧啶，但RNA中还存在少量的稀有碱基，如假尿嘧啶、二氢尿嘧啶等。4.核苷酸是核苷的磷酸酯，去掉磷酸基团后剩下的部分称之为核苷。如果核苷5端磷酸化，根据连接的磷酸基团的数目可以形成核苷一磷酸（通常说的核苷酸，如AMP、GMP等）、核苷二磷酸（如ADP、GDP等）或核苷三磷酸（如ATP、GTP等）。5.在核苷3

33、端磷酸化形成一个酯键，同一个磷酸又可以在同一个核苷的2端再形成一个酯键，形成一个环核苷酸。其中的环胸苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）是生物体的第二信使，它们可以将细胞外激素的信息传递给细胞内，引起重要的生理效应。,6.核酸的大小变化很大，他们可以与蛋白质非共价结合形成核蛋白，如染色质、核糖体和病毒颗粒。DNA是原核生物和真核生物的遗传信息载体，证明DNA是遗传物质的两个最著名的实验是肺炎双球菌转化实验和噬菌体感染实验。但在病毒中遗传材料或是DNA，或是RNA。7.DNA中的碱基组成是有规律的。Chargaff提出了一个重要的碱基定量关系，其中有一条重要法则：不管生物种属如何不同，所有的D

34、NA中，腺嘌呤摩尔数总是等于胸腺嘧啶摩尔数(即A=T)，鸟嘌呤摩尔数总是等于胞嘧啶摩尔数(G=C)。嘌呤碱基的总摩尔数等于嘧啶碱基的总摩尔数(A+G=T+C)。,9.在细胞内，大的DNA分子被压缩和包装。真核生物的组蛋白结合DNA形成核小体，每个核小体占有200个碱基对。核小体被串在一起，经一级一级地压缩，形成超螺旋附着在核内的DNA-蛋白质支架上。10.RNA的主要类型有：核糖体核糖核酸（rRNA），转运核糖核酸（tRNA）和信使核糖核酸（mRNA），他们在蛋白质合成中发挥着重要的作用。单链RNA分子本身可以折叠形成双螺旋区，双螺旋区RNA的螺旋构型类似于A-DNA构型。,11.通过可破坏氢

35、键或疏水相互作用的试剂，极端的pH、或通过悬浮于低离子强度的溶液中、加热等手法都可以使DNA变性。变性的DNA溶液的紫外吸收会增加（增色效应），通过热变性可以确定碱基组成（DNA中的GC的摩尔百分比）。处于熔点（Tm）的DNA有50的双链被打开。12.变性DNA可以经缓慢冷却（退火作用）重新复性形成双链DNA，紫外吸收也随之降低（减色效应）。变性的核酸混合物（含有几种不同核酸）在缓慢冷却(退火)过程中可以形成杂化双螺旋。通过核酸之间的杂化程度可以确定它们的核苷酸序列的相似性。13.原核生物中存在限制性内切酶，该酶可以在特殊部位切断外源DNA，甲基化酶催化该特殊部位的甲基化，保护细胞的DNA避免

36、被限制性内切酶切断。,小测试,1.RNA和DNA彻底水解后的产物：A.核糖相同，碱基相同B.核糖不同，碱基相同C.核糖相同，碱基不同D.核糖不同，碱基不同,2.腺嘌呤和鸟嘌呤在结构上的差别是腺嘌呤鸟嘌呤A.C6上有羟基，C6上有氨基B.C6上有甲基，C6上有甲基C.C6上有氨基，C6上有甲基D.C6上有氨基，C6上有羟基E.C6上有氨基，C6上有氨基,3.核酸中核苷酸之间的连接方式是：A.2，3磷酸二酯键B.3，5磷酸二酯键C.2，5磷酸二酯键D.糖苷键E.肽键,4.下列哪种碱基只存在mRNA而不存在于DNA中：A.腺嘌呤B.尿嘧啶C.鸟嘌呤D.胸腺嘧啶E.胞嘧啶,5.核酸对紫外线的吸收是由哪一结构产生的A.磷酸二酯键B.核酸成环C.嘌呤、嘧啶环上的共轭双键D.糖苷键,6.下列关于双键DNA碱基含量关系，哪个是错误的：A.A=T,G=CB.A+T=G+CC.A+G=T+CD.A+C=GT,7.DNA变性的原因是：A.温度升高是唯一的原因B.磷酸二酯键断裂C.多核苷酸链的解聚D.碱基的甲基化修饰E.互补碱基的氢键断裂,8.核小体串珠状结构的珠状核心蛋白是：A.H2A，H2B，H3，H4各一分子B.H2A，H2B，H3，H4各两分子C.非组蛋白D.H2A，H2B，H3，H4各四分子E.H1，H2，H3，H4各四个分子,谢谢！,