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1、IMMUNOLOGY,免疫学探索性实验,WeiChen,AssociateProfessorTheInstituteofImmunologyEmail:chenwei566Tel:88208286,Learningtolearn,learningbydoing,IhearandIforgetIread(see)andIrememberIdoandIunderstand荀子儒效:不闻不若闻之，闻之不若见之，见之不若知之，知之不若行之。学至于行之而止矣。,观察、学习、思考、行动,科学研究的目的兴趣什么是科学研究怎样做科学研究文献实验,科学研究的目的,1、宇宙由什么构成?2、意识的生物学基础是什么?
2、3、人类的基因为什么如此之少?4、遗传变异与人类健康在多大程度上彼此相关?5、物理定律能否统一?6、人类寿命可以延长多久?7、是什么控制着器官再生?8、皮肤细胞如何变成神经细胞?9、单一体细胞怎样成为完整植株?10、地球内部如何运行?11、我们在宇宙中是孤独的吗?12、地球生命是在哪里、如何诞生的?13、什么决定了物种的多样性?14、何种基因改变造就了独特的人类?15、记忆如何存储和提取?16、合作行为如何发展?17、怎样从海量生物学数据中获得大的图形模式?18、我们能在化学自组织方面走多远?19、常规计算的极限在哪里?20、我们能否有选择地切断某些免疫反应?21、量子不确定性和非局部性背后是
3、否有更深刻的原理?22、能否研制出有效的HIV疫苗?23、温室效应会使地球变得多热?24、什么时间用什么能源可以替代石油?25、马尔萨斯会一直错下去吗?,http:/www.sciencemag.org/content/309/5731/75.short,2013年十大科技突破,癌症免疫疗法大众基因显微手术脑成像技术人体胚胎克隆迷你器官宇宙射线的来源太阳能新星为什么睡觉微生物与健康疫苗设计,人造探测器首次登陆彗星被选为本年度最重要的科学突破。从恐龙到鸟的转变年轻血液有“返老还童”功效：血液中一种叫GDF11的蛋白机器人“自主”合作仿人脑芯片可治糖尿病的细胞：实验室中培养出酷似细胞的细胞。印尼洞
4、穴艺术操纵记忆：研究人员利用光遗传学技术操纵小鼠的特定记忆，如删除记忆或植入虚假记忆。立方体卫星：这种长宽高均为10厘米的廉价微型卫星在2014年真正获得成功生命基因密码“添丁”：自然界的DNA（脱氧核糖核酸）只有种碱基：G、T、C和A，但科学家设计制造的一种大肠杆菌的DNA添两个成员：X和Y。,2014年十大科技突破,癌症免疫疗法,今年6月，研究人员报告，结合使用伊匹单抗（即抗CTLA-4）和抗PD-1令1/3的黑色素瘤患者出现“深层和快速的肿瘤消退”。2011年，美国食品和药品管理局批准了百时美施贵宝针对转移性黑素瘤的伊匹单抗治疗。2012年，霍普金斯大学的SuzanneTopalian、
5、耶鲁大学的MarioSznol和同事报告了在近300名患者中使用抗PD-1疗法的结果，其中31%黑色素瘤患者、29%肾癌患者和17%肺癌患者的肿瘤萎缩了一半或更多。2013年，据百时美施贵宝报告称，在1800名使用伊匹单抗治疗的黑色素瘤患者中，22%的人在3年后仍存活。,什么是科学研究？,科学研究的基本任务就是探索、认识未知。我国国家教育部定义是：科学研究是指为了增进知识包括关于人类文化和社会的知识以及利用这些知识去发明新的技术而进行的系统的创造性工作。美国资源委员会对科学研究的定义是：科学研究工作是科学领域中的检索和应用，包括对已有知识的整理、统计以及对数据的搜集、编辑和分析研究工作。The
6、observation,identification,description,experimentalinvestigation,andtheoreticalexplanationofphenomena.,科学研究程序及实施（一）科研课题设计（二)科研课题实施(三）实验记录和原始实验数据保存（四）资料分析与论文撰写,科研课题设计1.文献调研*收集和学习国内外相关进展*注意：创新点及条件、方法2.确定研究目标*根据拟解决的关键问题，选择和准备实验对象、仪器、材料等*注意：创新性、现有条件、可行性、伦理学3.制定科研计划*实验方案（处理因素、观察指标、实验对象、实验条件等）；记录项目和格式；人员分
7、工*注意：合理、具体、明确、可操作、符合统计学原则4.预实验*校正仪器，摸索实验方法，优化实验条件*注意：保持仪器良好状态，尽可能确定最佳实验条件5.正式实验完善观察和记录格式，严格按规范进行,科研课题实施1.课题实施原则*设计实验方案及技术路线*确定可靠稳定的实验操作方法*精确准备实验材料*实验分组(设立对照)，排除非实验因素干扰2.确定实验条件*制订实验操作流程*规范操作技巧*落实实验材料来源*控制主观误差,实验记录和原始实验数据保存1.实验记录的内容实验名称、实验目的、实验方案（框架式实验方案及实验操作方案）、实验过程、实验结果及分析、实验记录的规范和保存2.实验小结实验数据整理和分析、
8、资料解释与科研结论,资料分析与论文撰写1.资料统计与整理2.实验结果判定3.科研结论4.论文撰写5.论文投送,生物医学科学研究的基本流程科学问题的提出研究对象的选择研究内容的选择（针对性）技术路线的选择技术方法的选择技术方法的建立实验结果的产生实验结果的总结和分析,研究设计,选题的基本过程,1.发现问题工作中发现学术交流灵感意外事件2.文献复习查阅文献资料3.假说形成4.确定课题,可行性分析,选题的方法,国家科研项目指南临床实践理论研究和学术争论文献启发科学领域空白点原有课题延伸、深入交叉学科的科学问题,研究立题：,研究设计：,做什么？,怎么做？,(一)研究要素的合理组合(二)研究设计原则(三
9、)研究条件的控制(四)研究过程的规范化,实验的两种基本类型1.现象观察解决有没有关键：从多个角度确证模型、方法、指标等的可靠性，对照系统的完善;2.机制分析解决为什么关键：一种外部表现与内在变化的联系相关性分析,发现和提出问题任何科学研究都是从发现和提出问题开始的。“问题”是科研活动的起点。提出问题选择并确立研究题目，就是科学研究的第一步，也是科研成败的关键。只有题目选得好，才有可能出成果。正确的提出问题等于解决了问题的一半。因此，科研选题必须具有明确的目的性，充分的科学性和先进性以及现实的可行性。,爱因斯坦：提出一个问题，往往比解决一个问题更重要，因为解决问题也许仅是一个数学上或实验上的技能
10、而已，而提出新的问题、新的可能性、从新的角度看旧的问题，则需要创造性的想象力，而且标志着科学的真正进步。,只有对自然现象能做敏锐观察的人，才可能有伟大的发现。在观察的领域中，机遇只偏爱那种有准备的头脑（巴斯德）。,法国生物学家、化学家、微生物学的奠基人巴斯德（LouisPasteur,1822-1895）在实验室里,有心人-初始意念(局限的、粗浅的）-“火花”。“火花”的出现是跳跃的、瞬间的，但思想上的积累和孕育过程是长期的。从偶然性机遇中发现必然性规律-机遇理性法。偶然性是必然性的反映和表现，必然性是偶然性的最终结果。初始意念要善于在观察中发现问题（弗莱明，1928年，penicillin）
11、要在怀疑中提出问题（哥白尼，1529年，日心说）要在灵感中提出假想（阿基米德,公元前240年，浮力）要在幻想中提出创意(达.芬奇，1886年,汽车）要在实践工作中提出思路（柯马克，1957年，CT）,1928年，英国科学家弗莱明和他当年发现青霉素的培养皿。1945年获诺贝尔奖,要善于在观察中发现问题（弗莱明，1928年，penicillin）,牛顿-万有引力发现者,要在怀疑中提出问题（哥白尼，1529年，日心说）,要在灵感中提出假想（阿基米德,公元前240年，浮力）,要在幻想中提出创意(达.芬奇，1886年,汽车）,1953年，沃森和克里克发现了DNA分子双螺旋结构。1962年获诺贝尔奖,20
12、世纪医学十大成就,1900年奥地利生理学家兰德斯坦纳等发现了人类的ABO血型系统1928年英国微生物学家弗莱明发现青霉素1936年前苏联首次成功进行肾移植1953年美国生物学家沃森和英国物理学家克里克首次确定人类DNA双螺旋立体结构1953年塞尔得格应用自制的器械成功地进行了动脉血管造影；1956年Dedman等又成功地完成了选择性腹腔动脉和肠系膜上动脉造影,1978年7月25日，世界上第一名“试管婴儿”路易布朗在英国诞生20世纪70年代柯马克和纽博尔德洪兹菲尔德发明了电子计算机X线断层显像技术（CT），80年代又出现了磁共振显像技术（MRI）1987年法国医生莫瑞特首先利用膀胱镜完成了世界上
13、第一例内镜下胆囊手术1996年7月英国爱丁堡卢斯林研究所培育出人类历史上第一个克隆绵羊“多利”1999年12月1日，英、美、日、加、法、中等国共同完成人类基因组工作草图的绘制,第一个试管婴儿路丝布朗1978年7月25日于英国诞生,1997年英国罗斯林研究所维尔穆特宣布第一只克隆羊多莉诞生,只有对自然现象能做敏锐观察的人，才可能有伟大的发现。在观察的领域中，机遇只偏爱那种有准备的头脑（巴斯德）。发现或提出问题的条件是：1勤动手2善观察3勤动脑4具有丰富的知识,研究立题：,研究设计：,做什么？,怎么做？,(一)研究要素的合理组合(二)研究设计原则(三)研究条件的控制(四)研究过程的规范化,每项实验
14、必须合理组织三项实验要素：1.试验对象2.处理因素3.试验效应,（一）、研究要素的合理组合,1试验对象试验对象是指被用于实验研究的生物体或生物材料。,（一）、研究要素的合理组合,主要采用实验动物以及哺乳动物来源的细胞或细胞株，少数实验利用人的组织。在动物、组织或细胞的整个处置过程中，须保持其合适的生活或生存条件,（一）、研究要素的合理组合,哪种动物的生理或病理特性与研究目标和要求最为吻合针对人类某种特性的研究，要根据哪种动物的特征与人类这种特性最为吻合制作病理模型，哪种动物最容易成功改变遗传性状的研究要根据动物生殖周期的长短动物繁育和饲养的方便程度及价格因素,实验动物的选择,2处理因素实验中根
15、据研究目的确定的由实验者人为施加给受试对象的因素称为处理因素，如药物、某种手术等。,（一）、研究要素的合理组合,（1）处理因素可以分为：一级处理（一般为病理模型诱导和建立）二级处理（一般为观察药物等的效应）三级处理（一般为拮抗增强药物效应）一些试验采用单一处理因素，一些实验有更多的处理因素，还有一些实验单纯观察某种自然变化而无处理因素。,（一）、研究要素的合理组合,（2）每种处理因素可以分为：单一水平（一种强度或剂量等），多种水平（几种强度或剂量等）。,（一）、研究要素的合理组合,处理因素处理因素和处理水平（1）单因素单水平（2）单因素多水平（3）多因素单水平（4）多因素多水平,（一）、研究要
16、素的合理组合,单一因素单一水平（主要用于人）组别目的处理组施加处理因素，观察处理引起的变化对照组不加处理，其它条件一致，以排除条件因素引起的变化,两种因素单一水平处理因素A：诱导脑缺血；处理因素B：低温（32）处理。,两种因素（模型、药物）和药物的五种水平组别目的处理组0、5、10、观察不同药物剂量对脑缺血的影响20、50mg/kg对照组0、5、10、观察药物对假手术动物的作用，排除药物20、50mg/kg本身对动物生理功能的影响,只有少量的对照组的情况，各种对照应当都在实验中采用；如对照组数量多，可以精简其中一些组别，但是应当有充足的理由。如前期研究、预实验或文献中已经证明某些组别无特殊效应
17、，可以考虑精简。对各种理论上应当设置的对照，必须加以考虑，不能无故忽略！,主要实验组别与相应的对照组，应当在同一时间和同一批次实验中交叉、平行进行。不同组别的实验，如将其中一个实验组在同一时间和同一批次进行，其他组别在另外的时间和批次进行，会产生较大实验误差，应当严加避免。,3试验效应试验效应是指处理因素诱导或自然发生的一类变化，通过检测各种指标变化来反映试验效应。,（一）、研究要素的合理组合,（1）试验效应的观察，有仪器测量的定量指标和人工观察的定性指标。应尽可能采用定量指标，对尚不能采用定量指标的，应当采用分等级的半定量评估方法及单盲法（即观察者不知道实验分组）。,（一）、研究要素的合理组
18、合,（2）各种指标可以从不同侧面反映试验效应，应当采用能够准确或较准确反映试验效应的指标。各种指标测定方法应当实验前加以确定，没有特殊理由在实验中不能随意改变。,（一）、研究要素的合理组合,（3）定量指标的结果以实际测定的数值表示；定性指标的结果以出现某种反应的动物数以及百分率表示；半定量指标的结果以等级数值表示。,（一）、研究要素的合理组合,举例：研究目的：阐明A分子在肺癌中的作用及有关机制处理因素：不同肺癌模型（与哪种类型肺癌有关）不同病变时间（变化的时间过程）试验对象：不同动物（发生在哪类对象）试验效应：不同检测手段（mRNA、蛋白等）不同分子检测（对A分子有无特异性）不同功能检测（与哪
19、类功能相关）,（一）、研究要素的合理组合,举例：研究目的：阐明A药体外抗肿瘤的作用及有关机制处理因素1：不同肿瘤系（保护哪类肿瘤）处理因素2：不同药物（是否为该药特定作用）浓度（效应定量，浓度依赖特征）时间（时间依赖特征）试验对象：肿瘤细胞试验效应：不同指标（对不同功能的影响）,（一）、研究要素的合理组合,对照控制试验条件随机分组的客观化减少抽样误差重复样本数及重复次数提高可靠性盲法降低人为主观因素的干扰,（二）研究设计原则,一、对照1、基础条件的对照正常对照或阴性对照，操作条件对照（如假手术）2、经典处理的对照阳性对照,（二）研究设计原则,3、试验条件对照4、自身对照和组间对照自身对照（动物
20、实验中少用）组间对照两种对照的同时采用,（二）研究设计原则,二、随机1、单纯随机法（随机数字表）2、均衡随机（分层随机）将调查总体按照一定标准（性别、年龄等）进行分层,然后在每一层中用简单随机抽样方式抽取样本进行调查。3、均衡顺序随机,（二）研究设计原则,三、重复同一试验的重复次数（样本量）；同一时间地点的多次重复（1）如处理组与对照组的反应差别较大，可使所需的样本量减少；反之，若两者差别不大，单靠增加样本量是不现实的，还应从专业角度考虑这种微小的差别是否有现实意义。,（二）研究设计原则,（2）试验手段、仪器设备越精密，所需样本量可减少。在试验中设计中应尽量注意仪器的校正、操作的规范化、指标的
21、统一等，以提高试验质量。,（二）研究设计原则,（3）从统计学角度看，要提高试验效率应注意以下几点：两组样本量相等，试验效率提高，可用较少的样本量取得显著的结论；定量指标数据的试验效率高于定性指标数据，故尽量将采用定量指标以提高试验效率；自身对照试验或配对试验可减少个体差异，提高试验效率，但应注意配对是否合理、前后两次测量值有无自然差异等。,（二）研究设计原则,（二）研究设计原则,四、盲法单盲法研究对象不知道自己所在的分组和所接受的处理，但观察者和资料收集分析者知道；双盲法研究对象和观察者都不知道分组情况，也不知道研究对象接受的处理措施；三盲法和多盲法研究对象、观察者和资料整理分析者均不知道研究
22、对象分组和处理情况，只有研究者委托的人员或药物的制造者知道，直到试验结束时才公布分组和处理情况。,1、环境条件的控制2、生理条件的控制3、试验条件的控制4、操作人员因素的控制5、条件的前后一致6、控制试验误差,（三）研究条件控制,1、环境条件的控制需要保持环境有适宜的气温和湿度、安静、相似的季节和昼夜时刻、无其他不良刺激等。对动物试验应当作更加严格的条件控制。由于有些试验动物生理过程的昼夜节律与人不同，如啮齿类动物（大鼠、小鼠等）是夜行性动物，其活动期在夜晚，静息期在白天，因此，用这些动物试验时，要选择适当和相同的昼夜时刻，并注意给动物保持光照和黑暗的时间。,（三）研究条件控制,2、生理条件的
23、控制受试对象的种族、性别、年龄、营养状况、遗传特征、各种生理功能状况等。在动物试验中，诸如血糖、血O2分压、血CO2分压、血及其他体液的pH、体温等生理因素。试验动物还应注意有无有关病原体（病毒、细菌、寄生虫等）感染。对动物实施麻醉，应当注意麻醉深度以及麻醉造成的生理功能改变，如体温降低、血压下降、心率加快等。,（三）研究条件控制,3、试验条件的控制受试对象仪器设备试剂材料试验实施条件操作规程（SOP）等,（三）研究条件控制,（1）受试者或动物应当按要求选择和随机分组，保证各组的基本条件基本一致，保持可比性。（2）仪器设备仪器设备的精确性、稳定性、可靠性都应符合试验要求，并且定期或试验前加以校
24、正；还要规范操作方法，以保证定量的准确。,（三）研究条件控制,（3）试剂材料各种药物、试剂、细胞株、其他材料等，应当符合试验要求，都要贴标签注明名称、含量、来源、批号、日期、试验人员姓名等，防止发生差错；必要时对其稳定性、含量、活性进行检测，保证试验的可靠性。,（三）研究条件控制,（4）试验条件应当事先确定各组条件，并严格按同一标准执行。（5）操作规程设计时应当制订切实可行，并且能保证试验质量的标准操作规程（SOP），并在实施规程中严格掌握。,（三）研究条件控制,4、操作人员因素的控制各种试验都是由研究人员来操作的，每个人员对各种条件和标准的掌握有不同程度的差异，这就会影响结果的准确性和一致性
25、，造成较大的误差，因此，要对人员操作因素加以控制。除了事先要统一执行标准的具体做法外，为了避免主观因素的干扰，采用盲法是一个有效的方法。,（三）研究条件控制,临床研究可采用双盲法，即受试者和研究者（包括数据分析人员）都不知道试验分组情况，因此受试者的反应和研究者的评判都较为客观。基础研究中，对一些容易受主观因素影响的定性或半定量指标，如动物行为学观察、病理切片观察等，应当实行单盲法，即负责观察的人员不知道处理方法和试验分组，而按照规定的标准进行观察，这样可以在很大程度上避免主观因素造成的偏差，使试验结果较为客观可信。,（三）研究条件控制,5、条件的前后一致研究的各种条件，如受试对象的基本特点、
26、动物及其品系、采用的仪器设备、各种试剂和材料、试验环境（温度、湿度、光照、噪声等）、试验方法、操作过程、采用的观察指标等，应当在设计时确定，研究全过程都要按照统一标准进行，中途改变条件会使试验结果前后难以比较，导致返工等问题。,（三）研究条件控制,6、控制试验误差随机误差（不可避免）系统误差（注意纠正）人为误差（应当克服）,（三）研究条件控制,1、规范化2、记录内容及要求,四、研究过程的规范法,1、规范化事先规定格式和内容培养严谨的习惯加强管理,试验记录,2、记录内容及要求（1）在记录本或记录表中，记录试验日期、试验场所当天的室温及湿度（必要时）、记录者签名、审核者签名（必要时）。（2）按照实
27、验方案逐日对每一试验对象进行观察和记录，注意对象的编号与记录一致。,试验记录,（3）临床试验中发现受试者出现不良事件，应及时记录，并作妥善的处理；动物试验中，发现濒死或者已死动物，要作记录和适当处理，必要时作病理学检查。（4）记录实验标本的收集和编号。（5）在研究过程中出现异常现象的，应做详细记录。,试验记录,（6）所用记录的数据应当做到直接、及时、清晰和不易消除，并应当注明记录日期，由记录者签名，专题负责人复核后签名。（7）记录的数据需要修改的，应当注明修改的理由以及修改日期，并由修改者签名；修改数据不得损毁原记录。,试验记录,免疫学探索性实验课题设计,1.中药香菇多糖能明显增强机体免疫功能
28、，试设计课题阐述香菇多糖对免疫系统的作用机制。2.临床患者感染H7N9病毒两周左右，如何确定其体内是否建立有效的免疫应答？3.临床患胰岛素依赖型糖尿病的病人，如何明确具体发病机制？,*免疫器官中枢免疫器官外周免疫器官*免疫细胞*免疫分子,免疫系统（immunesystem）的组成,免疫的核心内容,“自我”（self）“非我”(nonself),免疫应答immuneresponse,免疫耐受immunetolerance),Theprincipalmechanismsofinnateandadaptiveimmunity,Innateimmuneresponse,Physiologicalbar
29、riersskinmucousmembranesPhagocytosispolymorphonuclearleukocytes(PMN)monocytes/macrophagesNaturalkiller(NK)cellComplementandacutephaseproteins,Linksbetweeninnateandadaptiveimmunity,2005Elsevier,Typesofadaptiveimmunity.,Theclonalselectionhypothesis,Adaptiveimmuneresponse,Introduction,BCR(mIg),TCR,Thet
30、wo-signalrequirementforlymphocyteactivation.Signal1isprovidedbyantigenrecognition.Signal2isprovidedbycomponentsofthemicrobesorsubstancesproducedduringtheinnateimmuneresponse.,Downloadedfrom:StudentConsult(on31May200605:26PM),2005Elsevier,Tcell-mediatedimmuneresponse,ImmunologicalSynapse,A.TCRAg-MHCB
31、.CD28B7C.LFA-1ICAM-1D.LFA-2LFA-3,Anergy(concept),A.Only1stsignal,no2ndsignalB.No1stsignal,only2ndsignal,TheroleofcostimulationinTcellactivation,SignaltransductionpathwaysinTcellactivation,PIP2,Targetgenes:CKsandCKRsCAMsMHC,LAT,SLP-76,MAPK,thesubsetsofTcells,DifferentiationofThcells,Differentiationof
32、Thcells,Th1,Th2,ActivationofmacrophagesbyTlymphocytes,Tcell-mediatedimmuneresponse,Typeofadaptiveimmunity,(4)ActivationinducedTcelldeath,1)AICD(Activationinducedcelldeath)ActivatedTcellsexpressFasLthatinduceapoptosisofFaspositiveTcells.2)PassivecellapoptosisAg,survivalsignalsandgrowthfactors,Keypoin
33、t,GenerationofmemoryTcellsCD45RA-,CD45RO+Long-livedmemoryfaster,strongerandmoreeffectiveimmuneresponse,Tcell-mediatedimmuneresponse,Phasesofhumoralimmuneresponses,Effectorphase,TheinteractionsofThcellsandBcellsinlymphoidtissues,Downloadedfrom:StudentConsult(on1June200603:50PM),2005Elsevier,Mechanism
34、sofThcell-mediatedactivationofBcells,Bcell-mediatedimmuneresponse,Theedgeoflymphoidfollicle,Germinalcenter,Ch.11,p.294,Downloadedfrom:StudentConsult(on31May200605:26PM),2005Elsevier,免疫学探索性实验课题设计,中药香菇多糖能明显增强机体免疫功能，试设计课题阐述香菇多糖对免疫系统的作用机制。提示：包括固有免疫和适应性免疫应答。固有免疫：吞噬细胞（如巨噬细胞），自然杀伤细胞适应性免疫应答：细胞免疫和体液免疫，以及相关的细
35、胞因子（与抗病毒，抗肿瘤有关的细胞因子）,免疫学探索性实验课题设计,2.临床患者感染H7N9病毒两周左右，如何确定其体内是否建立有效的免疫应答？提示：主要是适应性免疫应答：细胞免疫：Th活化，CTL杀伤活性，细胞因子的释放（IL-2，IFN-等）体液免疫：特异性抗体的产生，B细胞的数量和功能，补体的活化3.临床患胰岛素依赖型糖尿病的病人，如何明确具体发病机制？提示：自身抗体检测和自身反应性T细胞检测,研究背景和研究意义科学问题的提出实验设计主要观察指标和实验方法预期结果和讨论参考文献,免疫学探索性实验课题设计,研究要素：处理因素，试验对象，试验效应研究设计原则：对照：对照组的设立随机：实验对象的分组重复：每组样本数，一批还是多批盲法,免疫学探索性实验课题设计,Thankyou!,